潜阳解毒通络饮通过PPAR-γ途径抑制炎症因子表达从而对自发性高血压大鼠炎症机制干预的研究

靳取 邓悦 常立萍

近期研究发现，炎症在高血压的发生中扮演了一个重要的角色［1］。Toll 样受体4 可参与人体中多种炎症过程［2］，促进人体血清中超敏C 反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，HS-CRP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor -a，TNF-a)、白介素1β(interleukin-lβ，IL-1β)等炎症因子的过多表达，引发炎症反应［3］，最终导致高血压病的发生。比格列酮是噻唑烷二酮类药物(thiazo-lid inediones，TZD)，为一类新型的人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ)激动剂，除了通过改善胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)而发挥降糖作用以外，更可以降低血压［4］。本实验从中医角度入手，采用潜阳解毒通络饮对自发性高血压大鼠(SHR)进行治疗观察，与阳性药缬沙坦和比格列酮作对比，通过ELISA 法和RTPCR 等方法检测大鼠血清和心脏组织中炎症因子的表达，来验证潜阳解毒通络饮在治疗高血压病中医证候中“风痰瘀络”证型的作用与疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性12 周龄原发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)71 只，魏-凯二世大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)10 只(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2012-0001)。潜阳组后因打斗死亡3 只。

1.2 主要试剂与药物

大鼠血清因子HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的ELISA试剂盒，购于安迪(上海)生物科技有限公司［R＆D Systems (Minneapolis，MN，USA)］。

潜阳解毒通络饮:夏枯草25 g、石决明25 g、莱菔子15 g、黄连15 g、丹皮25 g、泽泻15 g、丹参15 g、地龙15 g、牛膝25 g(0.389 g/ml)。潜阳组药物:夏枯草25 g、石决明25 g、地龙15 g(0.144 g/ml)。解毒组药物:莱菔子15 g、泽泻15 g、丹参15 g、黄连15 g(0.133 g/ml)。通络组药物:丹皮25 g、丹参15 g、地龙15 g、牛膝25 g(0.178 g/ml)。缬沙坦:80 mg/粒(0.4 g/ml)。吡咯列酮:30 mg/粒(0.3 g/ml)。

将上药用清水浸泡30 分钟，6～8 倍水煮2 次，每次煎1.5 小时，待将至常温后取汁，4℃冷藏。

1.3 主要仪器和设备

酶标仪(美国宝特Bio-Tek ELX800 全自动酶标仪)，大鼠尾动脉无创测量仪Coda20208(美国Kent scientific corporation)，RT-PCR 仪(GT9612)(北京百泰克生物技术有限公司)，紫外分析仪(ZF1-II)(上海嘉鹏科技有限公司)，凝胶成像仪［伯乐生命医学产品(上海)有限公司，Bio-Rad Laboratiories，USA］。

1.4 动物分组

将SHR 随机分为潜阳组、解毒组、通络组、全方组、缬沙坦组、吡格列酮组、SHR 空白对照组及正常血压对照组，适应性喂养1 周，自由饮水，室温(20 ±2)℃，高脂饲料。生药量分别为:潜阳组0.22 g/kg(0.8 ml/天)、解毒组0.15 g/kg(0.65 ml/天)、通络组0.27 g/kg(0.9 ml/天)、全方组0.58 g/kg(1.95 ml/天)、缬沙坦组0.00027 g/kg(0.16 ml/天)、吡格列酮组0.0001 g/kg(0.1 ml/天)，SHR 对照组及空白对照组每日给予生理盐水，计量与全方组相同0.58 g/kg(1.95 ml/天)。分别于药前及给药后2、4、6、8 周时采用大鼠尾动脉无创血压测量仪Coda20208测量大鼠安静清醒状态下尾动脉收缩压(SBP)，测量时间固定于测量日早上9∶00～12∶00。每只鼠连续测量SBP 3 次，间隔1～2 分钟，取平均值。

1.5 标本采集

喂养8 周后，给予25%的乌拉坦腹腔注射，麻醉后经腹主动脉取血4 ml，加入无任何处理的试管中，4℃，3000 r/min 离心10 分钟，取血清-80℃保存，用于炎性因子水平的检测;经腹主动脉取血后，立即打开胸腔，迅速取出心脏，冰生理盐水冲洗后，垂直于左心室长轴切取左室中部组织，经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。

采用大鼠血清因子ELISA 试剂盒测各组标本血清中HS-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度。

RT-PCR 法监测大鼠心肌组织中TNF-a、TLR4及PPAR-γ 的mRNA 的表达。全方组、解毒组、潜阳组、通络组、沙坦组、列酮组、SHR 组及Control 组在高脂饲料喂养8 周后处死，取心肌组织，用SimplyP总RNA 提取试剂盒提取上述组织的总RNA，测定纯度并定量后采用BioRT cDNA 第一链合成试剂盒使用说明书合成第一链cDNA，于(北京百泰克生物技术有限公司GT9612)PCR 仪行RT-PCR 反应。目的基因TNF-a，Forward Primer:5‘-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3'，Reverse Primer:5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3'，产物长度446 bp;TLR4 Forward Primer:5'-ATTTCTTGGCTTGATCAGTC-3'，Reverse Primer:5'-GGATGTCTCTATGCGATTG-3'，产物长度280 bp;PPAR-γ Forward Primer:5'-TCAGGTTTGGGCGAATG-3'，Reverse Primer:5'-TTTGGTCAGCGGGAAGG-3'，扩增产物长度152 bp;β-actin内参照物，Forward Primer:5'-CCCATCTATGAGGGTTAC-3'，Reverse Primer:5'-TCACGCACGATTTCC-3'，特异性扩增片段为143 bp。反应条件为:94℃预变性3 分钟;94℃变性30 秒，52℃退火30 秒，72℃延伸60 秒，72℃最后延伸5 分钟，共30 个循环。反应结束，由凝胶成像仪(Bio-Rad Laboratiories，USA)进行拍照后，用Alpha VIEW SA 分析软件进行分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析。各组实验数据以表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVAS)，以P ＜0.05 为有统计学意义，以P ＜0.01 有显著统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠尾动脉收缩压

治疗前，各治疗组间大鼠尾动脉收缩压经单因素方差分析，F=1.024，P =0.422，P ＞0.05，差异无统计学意义;治疗第8 周，各治疗组间大鼠尾动脉收缩压经单因素方差分析，F=2.352，P=0.032，P ＜0.05，差异有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组血压差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 治疗前、治疗第8 周各组大鼠的尾动脉收缩压(±s)

表1 治疗前、治疗第8 周各组大鼠的尾动脉收缩压(±s)

注:与正常血压对照组相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别n第1 周血压(mmHg) 第8 周血压(mmHg)全方组11179.0 ±11.84135.7 ±23.80 b解毒组10181.7 ±18.05147.2 ±22.12a潜阳组7182.6 ±20.64142.0 ±13.96a通络组10177.4 ±11.95135.6 ±31.25b沙坦组10174.9 ±12.19136.1 ±8.57b列酮组10182.4 ±14.59142.7 ±13.32b SHR 空白对照组 10183.7 ±13.01165.3 ±7.48正常血压对照组 1094.2 ±14.6188.7 ±13.22 b

2.2 ELISA 法测各组大鼠血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-a 的浓度

经全方组治疗的大鼠，血清中IL-1β 浓度低于其他治疗组，经单因素方差分析，F =10.051，P =0.001，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的IL-1β 浓度有显著性差异(P ＜0.05);TNF-a 浓度低于其他治疗组，经单因素方差分析，F =3.569，P =0.017，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TNF-a 浓度有极显著性差异(P ＜0.01);hs-CRP 浓度低于其他治疗组和对照组，经单因素方差分析，F=2.381，P =0.071，P ＞0.05，无统计学意义。全方组在与普通组相比，有不同程度的显著性降低 hs-CRP、TNF-a 及 IL-1β 的表达(P ＜0.05，P ＜0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度(±s)

表2 各组大鼠血清中hs-CRP、TNF-a、IL-1β 的浓度(±s)

注:与普通组相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别nhs-CRP(ng/ml)TNF-a(ng/ml)IL-1β(pg/ml)全方组113.58 ×10 -4 ±0.095 ×10 -9 b77.81 ×10 -4 ±4.564 ×10 -9 b0.54 ×10 -4 ±0.023 ×10-12 a解毒组104.32 ×10 -4 ±0.076 ×10 -985.72 ×10 -4 ±4.479 ×10 -9 b0.45 ×10 -4 ±0.055 ×10 -12 a潜阳组74.08 ×10 -4 ±0.163 ×10 -9126.45 ×10 -4 ±11.049 ×10 -9 b0.49 ×10 -4 ±0.036 ×10 -12 b通络组104.40 ×10 -4 ±0.289 ×10 -9 a121.79 ×10 -4 ±2.650 ×10 -90.64 ×10 -4 ±0.047 ×10 -12沙坦组104.19 ×10 -4 ±0.142 ×10 -980.85 ×10 -4 ±4.481 ×10 -90.55 ×10 -4 ±0.011 ×10 -12列酮组104.24 ×10 -4 ±0.101 ×10 -993.42 ×10 -4 ±3.060 ×10 -9 b1.01 ×10 -4 ±0.192 ×10 -12 SHR 空白对照组104.40 ×10 -4 ±0.169 ×10 -9 a120.17 ×10 -4 ±11.410 ×10 -9 b0.91 ×10 -4 ±0.311 ×10 -12正常血压对照组104.07 ×10 -4 ±0.243 ×10 -954.62 ×10 -4 ±15.843 ×10 -90.38 ×10 -4 ±0.050 ×10-12

2.3 RT-PCR 法测PPAR-γ、TNF-a 及TLR4 的mRNA 在大鼠心肌细胞中的表达

经全方组治疗的大鼠，与SHR 空白对照组及正常血压对照组对比，可显著降低TNF-a 及TLR4 在大鼠心肌组织中的表达(P ＜0.05)，增加PPAR-γ 在大鼠心肌组织中的表达(P ＜0.05)。在计算TNF-a 时，经单因素方差分析，F=1.068，P=0.426，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TNF-a 浓度有极显著性差异(P ＜0.01);在计算TLR4 时，经单因素方差分析，F =2.157，P=0.096，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的TLR4 浓度有显著性差异(P ＜0.05);在计算PPAR-γ 时，经单因素方差分析，F=1.339，P=0.296，P ＜0.05，有统计学意义，经两两比较后发现，全方组与正常血压对照组有的PPAR-γ浓度有极显著性差异(P ＜0.01);见表3，图1～3。

图1 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γmRNA表达的比较

图2 各组药物对大鼠心肌细胞中TNF-a mRNA表达的比较

图3 各组药物对大鼠心肌细胞中TRL4 mRNA表达的比较

表3 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表达的比较(±s)

表3 各组药物对大鼠心肌细胞中PPAR-γ、TNF-a、TLR4 的mRNA 表达的比较(±s)

注:与普通组组比，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别nPPAR-γ(u/ml)TNF-a(u/ml)TLR4(u/ml)全方组11122.38 ×10 -4 ±9.878 ×10 -4 b82.04 ×10 -4 ±13.751 ×10 -4 a123.99 ×10 -4 ±9.438 ×10-4 b解毒组1079.63 ×10 -4 ±6.609 ×10 -4 b121.59 ×10 -4 ±22.618 ×10 -4 b126.16 ×10 -4 ±25.352 ×10 -4 b潜阳组784.78 ×10 -4 ±5.186 ×10 -4 b89.04 ×10 -4 ±16.696 ×10 -4 b74.38 ×10 -4 ±4.993 ×10 -4 a通络组1069.00 ×10 -4 ±7.034 ×10 -4 b113.90 ×10 -4 ±28.187 ×10 -4 b99.68 ×10 -4 ±2.283 ×10 -4 b沙坦组1076.50 ×10 -4 ±1.432 ×10 -4 b157.92 ×10 -4 ±18.089 ×10 -4 b136.90 ×10 -4 ±8.216 ×10 -4 b列酮组1071.69 ×10 -4 ±7.072 ×10 -4 b107.69 ×10 -4 ±14.737 ×10 -4 b70.30 ×10 -4 ±6.168 ×10 -4 b SHR 空白对照组1056.98 ×10 -4 ±6.243 ×10 -4141.64 ×10 -4 ±15.708 ×10 -4 b123.04 ×10 -4 ±11.059 ×10 -4正常血压对照组1049.32 ×10 -4 ±8.756 ×10 -446.32 ×10 -4 ±4.209 ×10 -4 b102.81 ×10 -4 ±15.947 ×10-4

3 讨论

高血压病是危害人类健康的主要杀手，糖尿病、心脏病、脑卒中都与血压长期升高有密切关系［5］。研究发现，炎症因子在高血压的发生、发展及转归中占有重要的作用［6］。而各类炎症因子的上游基因TLR4 如何介导炎症反应的发生，现已成为研究热点。已有研究表明，TLRs 与心血管疾病发生与发展有着紧密的联系［7-8］。从TLRs 信号传导通路入手，找出其重要节点加以阻断，将成为控制炎症反应的重要手段，从而对由TLRs 信号通路激活导致的高血压、心肌肥厚等疾病进行有效的治疗。近年来对TLRs 信号转导通路的研究显示:NF-κB 是TLR4 信号转导MyD88 途径中重要的级联信号因子之一。TLR4/NF-κB 被激活后，各种激活诱导物(如细胞因子TNF-α，IL-1β)作用于NF-κB，使得其表达增加，导致IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 等炎症因子表达增加，发生炎症反应，同时这些炎症因子再作用于NF-κB，形成一个炎症循环［9］。可以说，致炎症因子TNF-α、IL-1β 既是TLR4/NF-κB 信号通路活化的上游因素，又是TLR4/NF-κB 信号通路活化的产物，两者相互作用，互为因果，形成炎症因子网络，使得高血压病得以发生及发展。现已证实，吡格列酮作为人工合成的是噻唑烷二酮(TZD)药物，可通过抗炎作用逆转原发性高血压左心室肥厚，可在临床广泛应用于糖尿病合并高血压患者。这给今后临床在治疗高血压病提供了一个新的思路和选择。

基于现代高血压病的研究，各种机制导致的全身小动脉血管收缩为引起高血压的主要表现，中医理论认为高血压属络病［10-11］，属本虚标实，或虚实夹杂之病证。不同原因导致的脉络绌急(“阳亢”—络风内动)为高血压发病的基础和主要机制，与现代生活方式不良密切相关，饮食不节，醇甘厚味(咸能入血)，滋生“痰浊”、“瘀血”为主要致病因素和病理变化，痰瘀互结，络脉受损，气血运行受阻，致太过不及，“阳亢”而络风内动，而有“痰瘀阻络，脉络绌急”为主要致病机制。瘀血痰浊，郁腐成毒，热毒化风，日久导致“毒损心络”，从而导致心脏发生肥厚重塑及心力衰竭。潜阳解毒通络饮是基于“痰浊、血瘀、阳亢”的高血压病理变化和“痰瘀阻络、脉络绌急、毒损心络”的高血压心肌肥厚病理机制而设，显示出平稳的降压作用，与郭宇光［12］等研究结果基本相同。

本实验采用潜阳解毒通络饮对自发性高血压大鼠进行治疗观察，实验发现:(1)潜阳解毒通络饮能够有效降低原发性高血压大鼠(SHR)的血压，降压趋势与阳性对照组相类似，但无统计学意义(P ＞0.05)。(2)潜阳解毒通络饮能够有效抑制SHR 大鼠血清中IL-1β、TNF-α 及hs-CRP 炎症因子的表达(P ＜0.05)。提示潜阳解毒通络饮可以从炎症角度对高血压进行干预。(3)分子生物学实验结果显示，潜阳解毒通络饮能够显著增加PPAR-γ 在原发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中的表达，同时抑制TLR4及TNF-α 在心肌组织中的表达(P ＜0.05)。中药干预原发性高血压大鼠(SHR)心肌组织中TLR4 及NF-κB 上游物质TNF-α 的基因表达明显降低，提示潜阳解毒通络饮抑制了炎症反应中TLR4 及TNF-α的转录与复制。

综上，实验证明中药潜阳解毒通络饮通过作用于PPAR-γ 途径介导抑制炎症因子表达，是其主要作用机制之一。其详细作用机制，尚待进一步研究。

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