慢性浅表性胃炎大鼠胃黏膜细胞凋亡与中医证型的相关性

王丽 王垂杰 孙晓婷

慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)是由多种原因引起的慢性胃粘膜浅表性炎症，此病是目前发病率较高的消化系统疾病之一。相关研究调查［1］得出结论，脾虚证和湿热证是其中较多见的证型。细胞凋亡是机体重要生理功能之一，在各组织器官、系统中都存在，而在胃粘膜的炎症病理变化中凋亡细胞明显增多［2］。本研究复制慢性浅表性胃炎大鼠脾虚证和湿热证病证结合模型，采用原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠胃上皮细胞凋亡水平，采用RT-PCR 法检测凋亡调控基因Bcl-2 mRNA 表达，以期从细胞凋亡的角度揭示CSG不同证候的实质，为建立“证”的微观辨证体系标准提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD 大鼠40 只［合格证号:SCXK(京)2007-0001］，体重(170 ±20)g，雌雄各半。

1.2 分组与造模

［3-5］方法进行模型复制。用随机数字表法选取10 只作为正常对照组，每天灌胃2 ml生理盐水直至造模结束，其它30 只按体重每天灌5%水杨酸钠溶液10 ml/(kg·d)，第一阶段造模时间为3 周。3 周后，将这30 只大鼠按随机数字表法分为3 组，分别为单纯CSG 组、脾虚CSG 组、湿热CSG 组。每组大鼠在每天灌胃5%水杨酸钠溶液10 ml/(kg·d)的同时，单纯CSG 组不给其它处理因素，脾虚组用破气苦降与饥饱失常法造脾虚模型，用小承气汤(大黄12 g、厚朴15 g、枳实9 g)换算成动物剂量浓缩后10 ml/(kg·d)每天1 次灌胃，隔天半量饮食，自由饮水;湿热组予200 g/L 的蜂蜜水自由饮用，隔日灌服10 ml/(kg·d)白酒，与白酒隔日灌服10 ml/(kg·d)油脂。第二阶段造模时间为2周。由于灌胃不慎及其它原因所致，湿热CSG 组大鼠死亡两只，脾虚CSG 组大鼠死亡1 只。

1.3 主要试剂

凯基一步法TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒，购自凯基生物公司。Trizol 试剂盒、RT-PCP 试剂盒、引物(2 对)、琼脂糖均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 指标检测

大鼠禁食24 小时，处死，剖开腹腔，迅速剪取胃组织100 mg，生理盐水冲洗后，放入-80℃冰箱保存备用。

1.4.1 TUNEL 法检测细胞凋亡水平 将胃组织制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反应液→加converter-POD→与底物DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。每组按随机数字表法取5只大鼠，每只取1 张切片，每个切片随机观察5 个视野(视野放大200 倍)，用BP70 图像分析软件(Olympus 公司)分析细胞凋亡结果，分别计数每个视野阳性细胞和阴性细胞数，取平均值作为切片阳性细胞数和阴性细胞数，以凋亡阳性细胞数和细胞总数(阳性细胞数与阴性细胞数之和)的比率作为该切片的细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。AI=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.4.2 RT-PCR 法检测凋亡调控基因 Bcl-2 mRNA 表达水平经过总RNA 提取→测总RNA 纯度→逆转录合成cDNA→PCR 扩增→琼脂糖凝胶电泳后，使用Gelpro32 凝胶成像分析软件分析各条带光密度值，用目的基因(Bcl-2 mRNA)/内参基因(βactin mRNA)光密度值计算RNA 指数(RI)表示RNA 含量。RI =目的基因光密度值/β-actin mRNA光密度值。每组随机取5 只大鼠。

1.5 统计学分析

实验数据均采用统计软件SPSS 17.0 处理，实验数据均以平均值±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。P ＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡指数比较

各组大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡指数排列顺序为脾虚CSG 组＞湿热CSG 组＞单纯CSG 组＞正常组。各组数值结果经Levene 检验方差齐，总体有差异，多组间比较采用LSD 法:正常组与其它3 组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.01);脾虚CSG 组与湿热CSG 组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)，脾虚CSG 组与单纯CSG 组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)，见表1。病理见图1。

表1 各组大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡指数比较(±s)

表1 各组大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡指数比较(±s)

注:与正常组比较，aP ＜0.01;与脾虚CSG 组比较，bP ＜0.05，cP ＜0.01

组别视野细胞凋亡指数(%)正常组250.07 ±0.03单纯CSG 组250.35 ±0.07ac湿热CSG 组250.37 ±0.07ab脾虚CSG 组250.43 ±0.09 a

2.2 各组大鼠胃粘膜凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达比较

RT-PCR 产物凝胶电泳结果显示，各组大鼠胃组织Bcl-2 mRNA 的RT-PCR 产物为大小约367 bp的条带，内参基因β-actin mRNA 的RT-PCR 产物大小约227 bp 的条带，用目的基因/内参基因光密度值计算RNA 指数。各组数值结果经Levene 检验方差齐，总体有差异，多组间比较采用LSD 法:3 个模型组较正常组Bcl-2 mRNA 表达均降低，脾虚CSG组Bcl-2 mRNA 表达最低，与单纯CSG 组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05)，与正常组及湿热CSG组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.01)，见表2，图2。

图1 各组大鼠胃粘膜上皮病理图

表2 各组大鼠胃粘膜凋亡调控基因Bcl-2 表达比较(±s)

表2 各组大鼠胃粘膜凋亡调控基因Bcl-2 表达比较(±s)

注:与脾虚CSG 组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01

组别n Bcl-2 mRNA 强度 内参强度Bcl-2 mRNA/内参正常组576.31 ±1.5489.22 ±1.000.86 ±0.011 b单纯CSG 组 566.43 ±4.0486.44 ±0.830.77 ±0.045a湿热CSG 组 569.12 ±1.8485.63 ±1.080.81 ±0.040b脾虚CSG 组559.34 ±5.4687.98 ±0.800.67 ±0.058

图2 Bcl-2 mRNA 与β-actin mRNA 的RT-PCR 产物电泳图

3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)是细胞在一定的生理病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，在各组织器官、系统中都存在。正常胃粘膜的结构和功能依赖于粘膜上皮细胞增殖和凋亡之间的动态平衡，而二者的失衡就可能引起病变。

Bcl-2 家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质。目前已经在哺乳动物、线虫和细菌中发现并鉴定出了Bcl-2 家族的20 余种蛋白质，根据它们在细胞凋亡中的作用可分为两类，一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2 等十余个成员;另一类是促凋亡蛋白。Bcl-2 可抑制多种组织的细胞凋亡，而且很可能是阻止凋亡最后的共同的途径［6］。

本实验通过观察慢性浅表性胃炎不同证型胃粘膜上皮细胞凋亡及凋亡调控基因Bcl-2 表达情况，探讨同一病理病变不同证型在细胞凋亡方面的差异所在。正常胃粘膜凋亡细胞较少，而在胃粘膜的炎症病理变化中凋亡细胞明显增多。本实验发现各组大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡指数排列顺序为脾虚CSG 组＞湿热CSG 组＞单纯CSG 组＞正常组。湿热CSG 组其胃粘膜炎症反应明显，细胞凋亡增多，而脾虚CSG 组为虚证，胃粘膜功能减退，细胞凋亡增加。

本实验发现三个模型组较正常组Bcl-2 mRNA表达均降低，脾虚CSG 组Bcl-2 mRNA 表达最低，与其它三组比较有统计学意义，与单纯CSG 组比较，P ＜0.05，与正常组及湿热CSG 组比较，P ＜0.01。可以得出结论，各组大鼠Bcl-2 mRNA 表达情况与各组凋亡情况呈负相关，这与以往的部分报道相一致，认为不同胃粘膜病理Bcl-2 蛋白表达与细胞凋亡指数呈负相关。

本实验表明，慢性浅表性胃炎不同证型大鼠根据其证的不同凋亡指数亦不同，其中脾虚CSG 组凋亡指数高于湿热CSG 组。另凋亡过程的发生与Bcl-2 的表达有密切的关系。

参 考 文 献

［1］ 谢淑颖，周晓虹. 慢性胃炎的中医常见证型研究［J］. 辽宁中医药大学学报，2009，11(4):53-54.

［2］ 高碧珍，兰启防，李灿东，等.慢性胃炎证候与幽门螺杆菌及Bcl-2 蛋白的相关性研究. 福建中医学院学报. 2003，12，13(6):1-3.

［3］ 翁一洁，郑学宝.大鼠内因湿热造模方法研究［J］.时珍国医国药，2010，21(2):479-480.

［4］ 王利芳，乔樵，朱曙东.云香复合胃痛胶囊对慢性浅表性胃炎大鼠胃分泌功能的影响［J］. 中国中西医结合消化杂志，2008，16(6):372-374.

［5］ 宋雅芳，王汝俊，刘友章，等.健脾益气中药对脾虚大鼠肝组织线粒体功能的影响［J］. 中药新药与临床药理，2009，20(5):423-426.

［6］ 彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床［M］. 北京:人民卫生出版社，2000:412-414.