婴幼儿呼吸道合胞病毒性毛细支气管炎血清ECPmRNA检测临床意义

詹 璐 邵征洋 王孙尧 林 隆 许先科 连俊兰 李志敏 贺 悦

杭州市红十字会医院儿科 杭州 310003

婴幼儿呼吸道合胞病毒性毛细支气管炎血清ECPmRNA检测临床意义

詹 璐 邵征洋 王孙尧 林 隆 许先科 连俊兰 李志敏 贺 悦

杭州市红十字会医院儿科 杭州 310003

毛细支气管炎 儿童 呼吸道合胞病毒 嗜酸细胞趋化蛋白 ECP嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）是嗜酸性粒细胞（Eos）释放的毒性颗粒蛋白，ECPmRNA通过表达进一步释放ECP，在炎症性和过敏性疾病中均发挥着重要作用，但对ECPmRNA对在呼吸道合胞病毒（RSV）感染的毛细支气管炎患儿中血清学含量变化研究较少[1-2]。本实验通过测定呼吸道合胞病毒性毛细支气管炎患儿血清ECPmRNA含量，探讨其对呼吸道合胞病毒感染的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年6月—2011年3月本院儿科住院诊治的毛细支气管炎患儿63例，其中男35例，女28例，年龄（8.8±0.2）个月。病例纳入标准：①初次发病。②诊断符合《诸福棠实用儿科学》第7版有关毛细支气管炎诊断标准。③除外先天性心脏病、结核感染及支气管异物等疾病。④经抗碱性磷酸酶桥酶标法（APAAP）检测鼻咽部分泌物确诊为RSV感染。⑤无个人和家庭过敏史（哮喘、过敏性皮炎、鼻炎）。⑥入院前2周未使用糖皮质激素。参照Bearman等[3]的毛细支气管炎临床症候评分标准，将63例分为轻症和重症两组。轻症组（≤6分）19例，男11例，女8例，月龄3～24个月，平均（8.6±0.2）个月。重症组（7～12分）44例，男24例，女20例，月龄4～24个月，平均（9.2±0.1）个月。另随机选取同期体检健康的婴幼儿21名作为对照组，其中男10名，女11名，月龄4～24个月，平均（8.5±0.2）个月。对照组与感染组年龄、性别等差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究为成组设计临床研究，实施前所有家长知情同意，并得到医院伦理委员会批准。

1.2 方 法

1.2.1 仪器与试剂 仪器Bio-tek酶标仪。RNA提取盒购自上海华舜公司；RT-PCR一步法试剂盒购自美国Promega公司；PCR引物由上海太阳生物科技公司设计并合成。

1.2.2 标本收集与测定 对所有纳入研究的患儿，在清晨空腹安静状态下采取静脉血3mL，分离血清于无RNA酶EP管（干冰操作），置于-70℃冰箱中。RNA提取按试剂盒说明进行操作，目的基因ECP引物如下：上游：5′GAAAGATGGGGCTGTTGAGT3′，下游5′CTTCTCACCACGAGGTAGCG3′，扩增片段长度为135bp；内参基因β-肌动蛋白引物：上游5′ATTCCTATGTGGGCGAOGAG3′，下游5′AGAGGC⁃GTACAGGGATAGCA3′，扩增片段长度为284bp。按说明书提取细胞总RNA，反转录反应合成互补DNA（cDNA），以cDNA为模板进行PCR扩增。RT-PCR反应条件[4]如下：cDNA合成和预变性：50℃逆转录30min，94℃ 2min进行1次循环；PCR扩增: 95℃变性，1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共32个循环，最后以72℃延伸10min。取5μLPCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min凝胶成像，应用图像分析软件分析各条带平均灰度值，结果以目的基因与β-肌动蛋白CT比值表示。

2 结果

轻症组、重症组及对照组血清ECPmRNA表达量分别为0.4530±0.0562、0.5012±0.0373、0.3929± 0.0305；各毛支气管炎患儿组血清ECPmRNA的表达量均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；重症组患儿血清ECPmRNA表达量高于轻症组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

感染组与对照组标本RT－PCR产物琼脂糖凝胶电泳图显示：在大约135bp和284bp位置，各电泳道均出现扩增条带，与ECP、β-actin预期扩增的目的条带位置一致。ECP和β-aFtin相应于135bp和284bp位置。见图1。

图1 ECP mRNA电泳图

3 讨论

ECP是一种单链糖蛋白，呈强碱性，由嗜酸性粒细胞活化释放，被认为是嗜酸性粒细胞的特异性标志。ECP反映了嗜酸性粒细胞的活化程度，具有强大的细胞毒性和神经毒性，可引起肥大细胞释放组胺，是造成气道炎症、气道高反应性、诱发和加重喘息的重要物质。毛细支气管炎是婴幼儿呼吸道感染的常见病，而RSV是毛细支气管炎的主要病源，大约有80%的毛细支气管炎由RSV[7]感染所致。流行病学调查发现，婴幼儿期患过RSV毛细支气管炎患儿50%～70%可反复喘息，甚至发展成哮喘[2-6]。因此RSV毛细支气管炎与以后发展成反应性气道疾病存在着密切关系。目前毛细支气管炎后出现反复喘息发作以及毛细支气管炎与哮喘之间的相关性已受到重视，通过采用候选基因的关联分析法来寻求可能的RSV易感基因研究，获得了大量天然免疫调节因子参与的证据[7]，其中很多研究就是关于ECP及嗜酸性粒细胞的。目前对于ECP与毛细支气管炎关系研究较多，主要集中在对于毛细支气管炎患儿鼻腔分泌物和血清液研究中，如Choi[8]及金可等[9]对毛细支气管炎患儿急性期鼻咽腔分泌物进行研究，研究表明鼻咽中ECP浓度明显升高，并且随病情好转而显著降低。既往研究[1]，毛细支气管炎患儿急性期血清中ECP浓度未见明显升高，并且随病情的好转无明显改变。但这两种实验对鼻部分泌物采样要求高[9]，易受到污染。而血清ECP带正电，呈弱碱性，不能通过血管内皮进入血循环或由血液进入气道，因此其血清未见阳性。对于ECPmRNA目前研究较少，ECP通过ECPmRNA进行表达，故通过ECP mRNA测定可以了解ECP的含量及在病理过程中的作用。本研究证实，血清ECPmRNA参与毛细支气管炎炎症过程，与病情密切相关，说明毛细支气管炎急性期有ECPmRNA分泌，嗜酸性粒细胞聚集并被激活，释放出ECP导致气道上皮细胞损伤，进而增加气道的过敏性炎症，引发喘息。

本组结果显示，血清ECPmRNA在重症毛细支气管炎表达高于轻症毛细支气管炎，提示症状越重其ECPmRNA含量越高，而健康儿童表达最低。ECP mRNA由嗜酸性粒细胞分泌，其对毛细支气管炎诊治有重要的临床意义。

［1］吴荣熙，王国健，李孟荣，等.ECP和IL-4、IL-5与RSV毛细支气管炎发病机制相关性研究［J］.中国实用儿科杂志，2001，16（5）：284-285.

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［6］Reijonen TM，Kotaniemi-Syrjane A，Korhonen K，et al.Predictors of asthma three years after hospital adimission for wheezing in infancy［J］.中国医学科学学报，2004，26（3）: 298-301.

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［9］金可，张海邻，陈小芳.呼吸道合胞病毒毛细支气管患儿鼻咽分泌物中IL-5及嗜酸性粒细胞趋化蛋白检测的临床价值［J］.实用儿科杂志，2006，22:1749-1751.

2012-07-12