蜂胶黄酮醇与羟丙基-β-环糊精包合物的稳定性

孟宪昉，白正晨，张弘青

（天津商业大学理学院，天津300134）

蜂胶中的黄酮醇类化合物是一种具有多种生理功能的天然活性物质。它的主要作用为清除自由基，临床上具有广谱抗菌、消炎、抗氧化、增强免疫力、降血压、降血脂、扩张冠脉、抗心律失常、抗肿瘤等作用，对胃及十二指肠溃疡、保肝护肝有一定疗效[1-5]。但由于其一般不易溶于水，口服吸收差，稳定性低，直接影响生物利用度和疗效。羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）是一种环状化合物，由7个葡萄糖单元形成类似圆柱体结构。圆柱体的空腔内相对疏水性，而其外侧则相对亲水性。由于这种特殊结构，使得蜂胶中的黄酮醇被其包合后具有较好的水溶性，便于被人体吸收，从而可以大大扩展黄酮醇类化合物的应用范围[6]。本文就光照、温度、pH、氧化剂、还原剂、金属离子以及几种常见食品添加剂等因素的影响，对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的稳定性进行了研究，确定了蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的使用与贮存的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

蜂胶：海南卓津蜂业有限公司提供；羟丙基-β-环糊精：ACROS，美国；槲皮素标准品、正己烷、盐酸、Na2SO3、H2O2、NaOH、ZnCl2、AlCl3、FeCl3、SnCl2、CuCl2、VC、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸三钠、苯甲酸钠、乙醇：均为分析纯，购自天津试剂经销公司。

1.2 仪器

岛津UV-2501PC紫外可见分光光度计：日本岛津公司；旋转蒸发器：天津玻璃仪器厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；AUY120电子天平：日本岛津公司；电热恒温水浴锅：天津中环实验电炉有限公司；DZG-401型电热真空干燥箱：天津天宇机电有限公司；PHS-3C酸度计：天津市航英科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂胶黄酮醇的提取及其和HP-β-CD包合物的制备

取10 g粗蜂胶用玻璃研钵粉碎，与质量分数为65%的乙醇以 1∶15（g/mL）的固液比混合，于 38℃水浴浸提3次（×4 h），合并提取液，充分抽提后，冷却，用纱布初滤，再用滤纸过滤，减压浓缩，回收乙醇，将正己烷和水按1∶4的体积比混合后倒入浓缩液中进行相转移，将脂溶性成分和水溶性成分分离，水溶性成分上树脂柱，用质量分数为60%的乙醇洗脱，然后减压蒸馏，真空干燥，得黄色粉状物，即为蜂胶黄酮醇[7-8]。

称取HP-β-CD 3.70 g于100 mL小烧杯中，加入40 mL蒸馏水，放在电热恒温水浴锅上，60℃热溶，另取1.4 g蜂胶黄酮醇于100 mL小烧杯中，加入50 mL甲醇于60℃热溶，将溶解的HP-β-CD移至250 mL双口烧瓶中，维持50℃，将溶解的蜂胶黄酮醇移至恒压滴液漏斗中，缓慢滴加至双口烧瓶中，于60℃回流4 h，关掉升温装置，自然降温并搅拌3 h，静置过夜，过滤，滤液进行蒸馏，回收甲醇，静置2 h，过滤，滤液进行浓缩，真空干燥，固体研磨即得产品。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的颜色反应与紫外光谱分析

将蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的乙醇溶液滴在滤纸上，干燥后喷1%三氯化铝乙醇溶液，加热烘干，于紫外光下观察其颜色；将蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物溶于1 mL乙醇中，加适量镁粉，滴加浓盐酸，观察其颜色；在试管中加入0.1 mL样品的乙醇溶液，再加等量的2%硼氢化钠的甲醇溶液，1 min后加浓盐酸数滴，观察其颜色。取蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物10 mg，用无水甲醇定容到10 mL的容量瓶中，适当稀释后，在220 nm～400 nm波长范围内进行紫外吸收波长的扫描。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

精确称取20 mg蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物加适量蒸馏水溶解后转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。配置系列浓度的蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物水溶液，选择272 nm处测定其吸光度。

1.3.3 蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的稳定性研究

分别取一定量蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物配制成溶液，测定光照、温度、pH、氧化剂、还原剂、金属离子以及几种常见食品添加剂条件下蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的吸光度，从而判断这些条件对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响。

2 结果与讨论

2.1 蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的颜色反应与紫外光谱分析

蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物与三氯化铝、盐酸-镁粉反应均呈阳性，硼氢化钠还原反应呈阴性，提示为黄酮醇类化合物；紫外光谱在272 nm和320 nm处出现两个最大吸收峰，显示有黄酮醇类化合物特征吸收。这与文献报道一致[9-11]。

2.2 蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的标准曲线

蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物浓度-吸光度标准曲线[12]，见表 1。

表1 蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物浓度-吸光度标准曲线Table 1 Concentration-absorbance standard curve on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

2.3 光照对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物样品配制成0.125 mg/mL溶液，分别取10 mL该溶液于试管中，置自然光和避光两种情况下进行对比试验，分别于 0、1、2、3、4 d 时取样，在 272 mn 波长下测其吸光度，见表2。

表2 光照对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 2 Effect of light on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，光照对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物有降解作用，随着光照时间的延长，降解速度加快，溶液颜色逐渐变浅。在避光条件下降解作用减缓。

2.4 温度对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物样品配制成0.100 mg/mL溶液，分别取10 mL该溶液于试管中，在20℃～100℃温度下保温20 min后冷却至室温，在272 mn波长下测其吸光度，见表3。

表3 温度对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 3 Effect of temperature on inclusion compound of propolisflavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，70℃以下，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度呈平缓的下降趋势，当温度超过70℃时吸光度下降幅度增大，溶液颜色由黄色逐渐变为淡黄色，表明，在20℃～70℃温度范围内，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的热稳定性较好，应在常温或70℃以下使用和保存。

2.5 pH对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物样品配制成0.124 mg/mL溶液，分别取10 mL该溶液于试管中，用HCl、NaOH分别调节pH为1～14，静置1 h后在272 mn波长下测其吸光度，见表4。

表4 pH对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 4 Effect of pH value on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，pH=1～3范围内蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度数值增大且变化明显；pH=5～10时吸光度数值平缓增大；pH=11～12时吸光度数值增大明显，溶液颜色加深；pH大于12时，溶液颜色进一步加深并开始出现浑浊。结果表明，在pH较低的酸性条件下，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的稳定性较差；在pH=5～10时蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度变化不大，稳定性较好；在较强碱性条件下蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性较差。

2.6 氧化剂对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物样品配制成0.086 mg/mL溶液，选择H2O2为氧化剂，在食品安全使用范围内（不超过2.0%）[13]，配制成含不同浓度H2O2的蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物待测液10mL，摇匀静置，在272 mn波长下测其吸光度，见表5。

表5 氧化剂对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 5 Effect of oxidant on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，随着氧化剂质量分数的增加，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度略有上升，但上升幅度不大，说明氧化剂对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响不大，认为蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物具有抗氧化作用。

2.7 还原剂对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物样品配制成0.086 mg/mL溶液，选择Na2SO3为还原剂，在食品安全使用范围内（不超过0.05%）[13]，配制成含不同浓度Na2SO3的蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物待测液各10 mL，摇匀静置，在272 mn波长下测其吸光度，见表6。

表6 还原剂对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 6 Effect of reductant on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，随着还原剂的质量分数增加，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度略有下降，但下降幅度不大，说明还原剂对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响不大，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物具有较好的抗还原性。

2.8 金属离子对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物样品配制成0.108 mg/mL溶液，分别加入H2O、Fe3+、Sn2+、Al3+、Cu2+和 Zn2+的浓度为 0.05 mg/mL，摇匀，分别放置0、1、2、3、4 d，在 272 mn 波长下测其吸光度，吸光度分别以 A0、A1、A2、A3、A4表示，见表 7。

结果表明，蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度受Cu2+和Sn2+的影响而明显下降，Zn2+几的吸光度变化与不添加金属离子的H2O组类似，说明Zn2+对包合物没有影响，而Fe3+和Al3+对蜂胶黄酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度的影响甚微，其吸光度下降的幅度小于不添加金属离子的H2O组，说明对包合物具有稳定作用。

表7 金属离子对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 7 Effect of metal ion on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

2.9 几种常用食品添加剂对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响

称取一定量蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物样品配制成0.093 mg/mL溶液，在不超过各食品添加剂在食品中的安全使用范围的基础上[13]，配置成含不同浓度食品添加剂的蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物待测液10 mL，摇匀，在272 mn波长下测其吸光度，见表8。

表8 几种常用食品添加剂对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稳定性的影响Table 8 Effect of some food additives on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

结果表明，柠檬酸和VC对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物稍有降解作用，柠檬酸三钠、蔗糖和苯甲酸钠对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的影响甚微。

3 结论

1）通过对产品的紫外光谱分析，其主要化学成分蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物为黄酮类类化合物。

2）在低温和pH5～10条件下蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物较为稳定，当温度超过70℃以及pH小于5和大于10时其稳定性较差。

3）Sn2+、Cu2+以及光照对其具有降解作用，随着时间的延长，降解速度加快。在贮存和运输过程中应尽量避免日光照射，并避免与含Sn2+和Cu2+的容器接触。柠檬酸和VC对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的影响很小，Fe3+、Al3+、Zn2+以及柠檬酸三钠、蔗糖和苯甲酸钠对蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物的影响甚微。

4）蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物具有良好的耐氧化性和耐还原性。

5）蜂胶黄酮醇和HP-β-CD包合物以水作为介质，便于人体吸收，在食品、医药和化工等行业应用更加广泛。

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