慢性乙型肝炎HBeAg 血清学转换与HBV 特异性细胞毒T 淋巴细胞、基因型的关系

吴寅涛，周玉麟 ，王学才

(1.宜兴市人民医院感染科，江苏 宜兴214200;2.宜兴市人民医院川埠分院感染科，江苏 宜兴214200)

在慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治疗中，乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)血清学转换是评价抗病毒疗效的重要标志之一。国内外研究显示，影响HBeAg 血清学转换的因素有多方面，但关于阿德福韦酯治疗CHB 患者后，HBeAg 血清学转换与乙型肝炎病毒(HBV)基因型、特异性细胞毒T 淋巴细胞(CTL)关系的相关研究并不多，本文通过观察采用阿德福韦酯治疗的80例CHB 患者，探讨其HBeAg血清学转换与外周血HBV 特异性CTL、HBV 基因型的关系。

1 对象与方法

1.1 临床资料

收集2009年1月至2012年5月我院感染科CHB 患者80例，诊断符合2005年慢性乙型肝炎防治指南的标准。其中男44例，女36例，年龄22 ～59(33.91 ±9.02)岁，病程1 ～10年;HBeAg 阳性50例(62.5%);所有患者均符合HBV DNA 阳性(HBV DNA≥1 ×105拷贝/mL);肝功能异常，丙氨酸转氨酶(ALT)＞2 ×正常值上限;人白细胞抗原(HLA)-A2阳性;均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染;无自身免疫性疾病;无长期大量饮酒史;无使用肝毒性药物史;以前未使用核苷(酸)类似物和干扰素抗病毒治疗或使用免疫调节药物。

1.2 治疗方法

患者服用阿德福韦酯(江苏省连云港正大天晴药业公司)10 mg，1 次/d，口服，疗程12 个月。

1.3 检测方法

HBVM 和HBV DNA:HBVM(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)应用AusBio 全自动酶免分析仪和上海科华公司试剂检测;HBV DNA:采用PCR 法，上海达安试剂检测。肝功能:用Olympus AU2700 全自动生化分析仪检测。

HLA-A2等位型的鉴定:取100 μL 肝素抗凝新鲜全血，加入检测管和对照管，分别加入HLAA2-PE 及同型对照10 μL，室温避光孵育30 min，经溶血处理后用流式细胞仪(BD FACSCalibur)和美国BD 公司试剂检测。HBV 特异性CTL:试管中加入10 μL 藻红蛋白标记的HLA-肽四聚体和CD8-异硫氰酸荧光素、CD3-PC5，再加入100 μL 的肝素抗凝血，同时做同型对照，混匀室温避光孵育20 min，溶血洗涤后，流式细胞仪检测，以CD3+淋巴细胞设门计数50000 个CD8+细胞和HLA-肽四聚体双阳性细胞为特异性CD8+细胞，并以占总计数CD8+细胞的百分比表示，美国BD 公司试剂检测。HBV 基因型:采用PCR 微板核酸杂交-ELISA技术，PE9600 型基因扩增仪(美国PE 公司)，试剂为第一军医大学基础生物医学诊断研究中心提供。引物及探针:选择前C 区的不同序列作为PCR引物和核酸杂交探针，6 个基因型通用的序列作为PCR 的引物和通用包被探针，而同一部位的不同序列作为各型的显色探针。显色探针5＇标记生物素，由上海生物工程公司合成。引物序列:引物1，5＇-CCCTTCTTCGTCTGCG-GTTCC-3＇(ntl490-1510)，引物2，5＇-ACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3＇(ntl 798-1777)，按说明书操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件。计数资料用百分数表示，采用χ2检验，计量资料用均数± 标准差(¯±s)表示，采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBeAg 血清学转换率

HBeAg 阳性50例中发生HBeAg 转阴14例(28%);HBeAg 血清学转换9例(18%)，无HBeAg血清学转换41例(82%)。

2.2 HBeAg 血清学转换率与HBV 基因型的关系

HBeAg 血清学转换9例中，B 基因型7例，占B基因型30.77%，C 基因型1例，占C 基因型4.17%;两种基因型比较，差异有统计学意义(χ2=4.32，P＜0.05)。

2.3 CHB 患者治疗前与治疗后12 个月肝功能、HBV DNA 和HBV 特异性CTL 水平比较

80例CHB 患者治疗前与治疗后12 个月肝功能、HBV DNA 和HBV 特异性CTL 水平比较，见表1。

表1 治疗前与治疗后12 个月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特异性CTL 水平比较±s

表1 治疗前与治疗后12 个月患者肝功能、HBV DNA 和HBV 特异性CTL 水平比较±s

组别 n 丙氨酸转氨酶/U·L -1总胆红素/μmol·L -1白蛋白/g·L -1 HBV DNA/log10拷贝·(mL)-1 HBV 特异性CTL/%治疗前 80 253.49 ±119.91 19.61 ±10.21 41.44 ±3.21 6.25 ±0.70 0.34 ±0.10治疗后 80 40.11 ±6.15 17.19 ±5.86 42.31 ±3.51 3.01 ±0.25 0.68 ±0.11 t 值 11.51 1.79 0.18 12.62 8.58 P 值＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

目前研究认为，乙型肝炎的发病机制主要是机体清除HBV 而引发的细胞免疫病理改变;机体清除HBV 的细胞免疫机制可分为特异性与非特异性2种，其中特异性细胞免疫应答可能是机体清除病毒的重要途径。HBV 特异性CTL 应答在乙型肝炎发病机制中的作用日益受到重视，在未经治疗的慢性乙型肝炎患者体内，往往存在T 细胞的低反应［1]。本研究显示，除能明显降低CHB 患者ALT 及HBV DNA 外，阿德福韦酯还能提高CHB 患者的HBV 特异性CTL 功能，治疗12 个月后HBeAg 血清学转换者与HBV 特异性CTL 水平升高可能有关，并可能与HBV 基因型有关。

国外研究认为阿德福韦酯的抗病毒作用与HBV 基因型无关［2]，这主要是由于国外研究多关注基因A 型与D 型，观察基因B 型与C 型较少，而我国患者感染以基因B 型与C 型为主［3]。曾爱中等［4]研究认为，阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎48 周时，部分病毒学指标(如血清HBV DNA 下降均值和HBV DNA 阴转率)B 基因型HBV 感染者优于C 基因型。本研究发现，HBeAg 血清学转换者9例中，B基因型7例(占B 基因型30.77%)，C 基因型2例(占C 基因型4.17%)，B 基因型HBeAg 血清学转换明显高于C 基因型。据此推断，HBV 基因型(B型与C 型)可能是阿德福韦酯治疗HBV 患者发生HBeAg 血清学转换的影响因素之一。

［1]Rehermann B，Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection［J]. Nat Rev Immunol，2005，5(3):215-229.

［2]Westland C，Delaney WT，Yang H，et al. Hepatitis B virus genotypes and virologic response in 694 patients in phase Ⅲstudies of adefovirdipivoxil［J]. Gastroenterology，2003，125(1):107-116.

［3]Zeng G，Wang Z，Wen S，et al. Geographicdistribution，virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in china［J]. J Viral Hepat，2005，12(6):609-617.

［4]曾爱中，邓惠，彭凤英，等. B 和C 基因型乙型肝炎病毒对阿德福韦酯治疗的病毒学应答比较［J].中华肝脏病杂志，2008，16(6):412-415.