坚强肠球菌SQ-3-2基于Lux S群体感应系统信号分子AI-2的检测及方法优化*

张腾，贺银凤

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特，010018)

群体感应(quorum sensing，简称QS)即细菌随着菌体密度的增大和生长周期的变化分泌出一种或几种化学信号分子，通过这些信号分子进行种内或种间交流，协调群体行为［1］。QS现象已经被证实可以调控很多细菌生理生化功能的变化，如生物发光、生物膜形成、细菌毒性、芽孢形成、结合感受态形成、生物群游速率和细菌素的产生等［2］。近几年的研究表明，二类信号分子(Autoinducer-2，简称AI-2)在微生物细胞间交流中起到关键作用，广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中［3］。

1993 年，Bassler［4］等最初在哈维氏弧菌(Vibro harveyi)中发现AI-2作为信号分子调控V.harveyi的生物发光现象，这是AI-2首次被人们所知。目前已知大约70多个种属的细菌基因组中都含有luxS的同源序列［3］，并且AI-2的生物合成途径基本都是相似的［5］。AI-2的生物合成与细菌一碳单位的代谢有关，即 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的代谢途径之一。SAM将甲基转移到底物之后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH对SAM依赖的甲基转移酶有很强的抑制作用，即SAH对细胞有毒害作用。故SAH在生成之后迅速被S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶降解为S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。随后LuxS催化SRH生成同型半胱氨酸和4，5-二羟基-2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，简称 DPD)，DPD 是合成AI-2的前体物质［5］，其易溶于水自发环化形成几种呋喃糖，排出胞外成为AI-2信号分子。在高细胞密度的情况下，信号分子扩散进入细胞，当信号分子在细胞内达到一个特定的浓度阈值后，与胞内的信号分子接收器 LuxR蛋白结合，并与启动子区和RNA聚合酶相互作用，启动基因表达，激活荧光操纵子的转录和生物荧光的产生［6］。

大量研究表明，Lux S介导的群体感应系统对肠球菌属微生物的耐药性及多种生理现象有重要的调控作用［11］，且Lux S介导的群体感应系统可能在乳杆菌属微生物中调控二类细菌素的产生［8］。本课题组之前的研究发现坚强肠球菌SQ-3-2可以高产抑菌物质，抑制枯草芽孢杆菌和假单胞李斯特氏菌的生长［9］。故在前人研究的基础上，我们首次进行了Lux S介导的群体感应系统对坚强肠球菌SQ-3-2产生细菌素及其生理功能的影响的研究。坚强肠球菌SQ-3-2是否存在Lux S介导的群体感应系统以及是否产生具有活性的AI-2信号分子还尚未见报道，且其培养过程中产生的大量有机酸和细菌素较大程度的影响了检测过程，故本研究着力探讨了坚强肠球菌SQ-3-2的AI-2信号分子的产生和检测，并对检测方法进行了优化，为检测乳酸菌中的AI-2信号分子奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

实验菌株坚强肠球菌SQ-3-2分离自内蒙古锡盟地区酸马奶酒中，由内蒙古农业大学“酸马奶酒中抗菌因子的研究”课题组提供。

哈维氏弧菌BB170购自ATCC。哈维氏弧菌BB170系哈维氏弧菌BB120的定向突变菌株，其AI-1信号分子的感受器是缺失的，故仅对AI-2信号分子发生反应并发光。此外其产生AI-2信号分子的lux S基因是完整的，在菌体密度达到一定程度时，可以自行产生AI-2。哈维氏弧菌BB170是目前国际上通用的便捷有效的检测AI-2信号分子的指示菌株［10］。

1.1.2 培养基

MRS培养基购自广东环凯微生物有限公司;2216海生菌液体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司;AB培养基依照文献［10］配制。

1.1.3 主要仪器设备

Perkin Elmer多功能酶标仪;Thermo 96孔板酶标仪(检测范围0～6 abs，线性范围0～4 abs，准确度±0.001);精达HZQ-C气浴恒温振荡器;智净SW-CJ-1FD超净工作台;HIRAYAMA高压锅;SK-1快速混匀器;LG10-24A离心机;Sartorivts PB-10pH仪，96孔酶标板购自Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌发酵上清液的制备

30℃条件下，将在MRS培养基中活化2代且培养至对数期的坚强肠球菌SQ-3-2按照1∶100的接种比例接种至新鲜MRS培养基中，继续培养至6、8、10、12、14、16、18、20、22 和 24 h，使用 Thermo 96 孔板酶标仪测定各时间点的OD630nm吸光度值。分别取上述10个时间点坚强肠球菌SQ-3-2培养液1 mL于1.5 mL无菌离心管中，6 000 r/min离心10 min，使用无菌1 mol/L的KOH溶液调离心上清液pH至7.0，保留一个培养18 h的样品不调酸，用于方法优化分析。将上述所有样品通过0.2 μm无菌过滤器过滤，去除上清液中坚强肠球菌，获得不同时间段坚强肠球菌SQ-3-2的无菌培养上清液，用于后续检测。

30℃有氧条件下，将哈维氏弧菌BB170在2216海生菌培养基中活化2代，按1∶100的比例接种至AB培养基中，过夜培养后使用上述同样方法制备哈维氏弧菌BB170无菌培养上清液，用于阳性对照。

1.2.2 坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液中信号分子AI-2的检测

发光检测实验方法据文献［11］修改得到。30℃条件下，将哈维氏弧菌BB170在2216海生菌培养基中活化2代，按1∶100的比例接种至AB培养基中，有氧过夜培养。当培养基OD630nm吸光度值为0.6左右时，按照1∶1 000比例稀释到新鲜AB培养基中，混匀备用。

新鲜AB培养基、哈维氏弧菌BB170过夜培养无菌上清液、新鲜MRS培养基和坚强肠球菌SQ-3-2培养至18h的调酸与未调酸的无菌培养上清液分别作为空白对照、阳性对照，MRS培养基对照和待测样品，每个样品分别按照1∶10的比例与过夜培养稀释后的哈维氏弧菌BB170菌液混匀，设置两个平行，继续置于30℃有氧培养。0～7 h之内每0.5 h使用96孔酶标板于Perkin Elmer多功能酶标仪化学发光模式下(300～700 nm总光量)测定发光强度，同一块酶标板再置于Thermo 96孔板酶标仪中测定OD630nm吸光度值，每板均取复孔，每孔加样量为200 μL。

1.2.3 哈维氏弧菌BB170活菌数与OD630nm吸光度值关系

将30℃过夜有氧培养至OD630nm为0.6左右的哈维氏弧菌BB170稀释1 000倍，稀释后继续置于30℃下有氧培养。每隔1h使用Thermo 96孔板酶标仪测定OD630nm吸光度值，同时取菌液梯度稀释后涂平板计数。

1.2.4 坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液中信号分子AI-2检测的方法优化

将坚强肠球菌SQ-3-2培养18h上清液分为调酸(pH 7)与未调酸2 组，每一组均按照1∶10、1∶50 和1∶100的比例与1 000倍稀释后的哈维氏弧菌BB170菌液混合均匀，取荧光强度差别最大的4h处测定各组不同加样比例的荧光强度，测定方法同上。阳性对照加样比例为1∶100。

1.2.5 坚强肠球菌SQ-3-2培养不同时间点信号分子AI-2的检测

将上述制备好的6～24 h的10个时间点的坚强肠球菌SQ-3-2调酸培养上清液，按照1∶100的比例过夜培养后稀释的哈维氏弧菌BB170菌液混匀，发光检测方法同上，测定不同时间点坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液中信号分子AI-2的活性。

2 结果与分析

2.1 坚强肠球菌SQ-3-2培养上清中AI-2信号分子的检测

利用坚强肠球菌SQ-3-2培养18 h的调酸与未调酸无菌培养上清作为待测样品进行发光检测。实验结果就荧光强度对孵育时间绘图，见图1。图1中加样比为1∶10，结果显示前3 h各组的荧光强度均下降，其中未调酸待测样品荧光强度显著低于其他4组。此后，由于空白对照中的AI-2没有达到一定浓度，其发光强度继续降低。而坚强肠球菌SQ-3-2调酸组和阳性对照滤过上清荧光强度降低趋势平缓，在荧光强度差别最大的4 h处，坚强肠球菌SQ-3-2调酸组荧光强度大于空白对照，小于阳性对照，说明待测样品中含有AI-2，但由于方法或其他原因AI-2的浓度小于阳性对照。4 h后各组均呈现上升趋势。在共同孵育4.5 h后，所有样品的荧光强度均上升。

图1 加样比为1∶10的不同孵育时间各样品的荧光强度Fig.1 The luminescence of different incubation time of samples ratio of 1∶10

图2 加样比为1∶10的不同孵育时间各样品的OD630 nm吸光度值Fig.2 The OD630 nmabs of different incubation time of samples ratio of 1∶10

同时对不同时间点哈维氏弧菌BB170进行OD630nm吸光度测定，结果见图2。结合图3共同显示，加样比1∶10的未调酸待测样品的OD630nm吸光度值并未发生明显变化，说明其较大程度的抑制了哈维氏弧菌BB170的生长。其他样品的吸光度值随时间的增长逐渐变大，并保持在同一水平，说明其他4组对哈维氏弧菌BB170菌体生长影响不大，保证了不同时间点哈维氏弧菌BB170菌体数量在同一水平。说明坚强肠球菌SQ-3-2可以向细胞外释放AI-2信号分子，并且使哈维氏弧菌BB170产生荧光。

图3 哈维氏弧菌BB170活菌数与OD630 nm吸光度值的关系Fig.3 The relation between viable count of V.harveyi BB170 and OD630 nmabs

2.2 坚强肠球菌SQ-3-2培养上清中AI-2信号分子检测的方法优化

选择共同孵育后荧光强度强度差别最大的4 h处测定不同加样比例各样品的荧光强度，见图4。结果显示调酸待测样品较未调酸样品相对荧光强度大，其中调酸后加样比为1∶100的待测样品相对荧光强度最大且高于阳性对照，而未调酸加样比为1∶10的待测样品相对荧光为0。共同孵育4h处不同样品的OD630nm吸光度值见图5所示，除未调酸加样比为1∶10的待测样品外，其他各组OD630nm吸光度值均保持在同一水平，说明哈维氏弧菌BB170生长水平一致。

图4 孵育4 h不同加样比例各样品相对荧光强度Fig.4 The relative luminescence of different sample ratio of incubation time 4 h

方法优化实验结果说明，最优检测条件为待测样品 pH=7，加样比例为1∶100。

2.3 坚强肠球菌SQ-3-2生长不同时期培养上清液中AI-2信号分子的浓度

使用优化后的检测方案，我们测定了坚强肠球菌SQ-3-2培养不同时间点AI-2信号分子的浓度。由于在共同培养4 h的时候，对照与样品之间荧光强度差别最大，故取各待测样品(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)均于与哈维氏弧菌BB170同培养后4h测定，其相对荧光强度(相对荧光强度=样品荧光强度/AB培养基作为空白对照)的荧光强度如图6所示。结果结合图7显示，随着培养时间的延长，坚强肠球菌的数量不断增加，相对荧光强度也随之增加，说明随着坚强肠球菌菌群密度的增加，其分泌的信号分子AI-2的量也随之提高，并在对数期末期达到最大值。当坚强肠球菌菌体密度超过一定范围时，即进入稳定期后，检测到的荧光强度则明显下降。

图5 孵育4 h不同加样比例各样品OD630 nm吸光度值Fig.5 The OD630 nmabs of different sample radio of incubation time 4 h

图6 不同培养时间坚强肠球菌SQ-3-2上清相对荧光强度Fig.6 The relative luminescence of supernatant solution of E.durans SQ-3-2 in different incubation time

3 讨论

3.1 哈维氏弧菌BB170的发光检测

哈维氏弧菌BB170过夜培养后产生大量AI-2信号分子诱导自身菌体产生荧光，稀释1 000倍后，荧光物质随时间推移逐渐淬灭，到4 h左右荧光强度降低到最低值，之后随着菌体的生长其自身开始合成AI-2信号分子，并诱导菌体大量产生荧光物质发光。若哈维氏弧菌BB170在荧光淬灭的过程中，周围环境中存在有大量AI-2信号分子，这些AI-2可以诱导菌体产生部分荧光物质，故其荧光淬灭过程变化较为缓慢，依据这一原理可以指示出周围环境存在AI-2信号分子。本研究探讨了坚强肠球菌SQ-3-2是否可以合成并分泌AI-2。依据文献［12］的研究发现，大量乳酸菌产生AI-2信号分子的最大值均出现在对数期末期，故我们选择了坚强肠球菌SQ-3-2对数生长末期18h的培养上清进行了检测。发现加入样品后，由于空白对照中的AI-2浓度不足以使哈维氏弧菌BB170发出荧光，其荧光强度曲线呈下降趋势，而哈维氏弧菌BB170和阳性对照的荧光强度曲线下降趋势不明显。该结果表明坚强肠球菌SQ-3-2滤过上清液和阳性对照相同，均含有足够剂量的AI-2，从而使哈维氏弧菌BB170在被自身产生的AI-2诱导前发出荧光。在共同孵育4.5h后，由于哈维氏弧菌BB170本身能够产生AI-2，所有样品随着哈氏弧菌BB170产生AI-2浓度的升高，荧光强度均上升。由于最终所有样品都会发出最高强度的荧光，所以，待检测的样品务必于哈氏弧菌BB170被自身产生的AI-2诱导发光前进行检测。

图7 不同培养时间坚强肠球菌SQ-3-2的OD630 nm吸光度值Fig.7 The OD630 nmabs of E.durans SQ-3-2 in different incubation time

3.2 检测条件的优化

依据文献［13］的研究发现，哈维氏弧菌BB170构成的AI-2检测体系的最佳pH值应与其自然生长下的pH值相同，过酸或者过碱均会对指示菌的发光性产生影响，而哈维氏弧菌BB170自然生长下的pH值大约在7左右。故在检测条件优化实验中，未调酸待测样品按1∶10加样比例添加，由于酸度过大，超过了AB培养基磷酸盐缓冲体系的缓冲范围，导致培养基pH值下降，对哈维氏弧菌BB170产生荧光和菌体生长不利，故不采用。调酸后的待测样品按照1∶10和1∶50比例添加，由于培养上清液中含有大量抑菌物质和其他发酵产物，可能对哈维氏弧菌BB170继续产生荧光有影响，故也不采用。故从最优角度出发，选择将待测样品调整酸度至pH=7，按照1∶100的加样比例添加。此时体系中既含有足够量的AI-2信号分子诱导哈维氏弧菌BB170产生荧光，同时又避免了培养上清液中酸度和抑菌物质对指示菌的影响。

3.3 坚强肠球菌SQ-3-2生长不同时期培养上清液中AI-2信号分子的测定

在坚强肠球菌SQ-3-2生长不同时期培养上清液中AI-2信号分子的浓度实验中，坚强肠球菌随着菌体密度的增加向胞外分泌AI-2信号分子的数量也随之增多，直到对数期末期到达最大值，进入稳定期之后AI-2信号分子数量开始减少。目前已知的报道中，大部分微生物菌种产生AI-2的峰值均出现在对数期末期，进入稳定期之后随之减少，这可能是由于大量AI-2信号分子被菌体重吸收或附着在细胞膜表面，调控稳定期的某些重要生理功能。

我们通过生物发光实验检测到坚强肠球菌SQ-3-2的培养液可以诱导特异性检测AI-2信号分子的哈维氏弧菌报告菌株BB170发光，证明了坚强肠球菌SQ-3-2的lux S基因具有活性，Lux S蛋白作为该菌AI-2合成过程中的关键酶发挥了作用。这为进一步研究坚强肠球菌SQ-3-2的AI-2及lux S基因的功能奠定了基础。而检测条件的优化实验则为乳品科学中研究乳酸菌群体感应信号分子AI-2的检测提供了一定的实验基础和理论依据，可以更好更清楚的了解多菌种发酵中菌种直接的相互作用和关系。

4 结论

(1)采用哈维氏弧菌BB170作为指示菌产生荧光方法可以检测到坚强肠球菌SQ-3-2产生的信号分子AI-2，优化的检测条件为待测样品调节pH=7且加样比为 1∶100。

(2)坚强肠球菌SQ-3-2可以向细胞外释放AI-2信号分子，随着坚强肠球菌菌群密度的增加，其分泌的信号分子AI-2的量也随之提高，并在培养16h的对数期末期达到最大值。

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