生物分离工程综合实验的设计

赵东旭，罗爱芹，李 春，张建丽，周晓宏，杨新芳

在高等教育过程中，实验教学对于促使学生加强对书本知识的理解、掌握基本的实验设计方法和操作技能、增强感性认识、贯彻系统性实践的能力等，具有不可替代的作用，应该受到更多的重视，加强新型交叉学科生物工程专业学生的实践创新能力更是迫在眉睫［1－2］。生物分离工程课程是生物工程专业的必修基础课程，生物分离工程的实验环节不同于传统的化工分离操作，其在上游生物工程、发酵技术的基础上，从浓度稀、成分复杂、物料不稳定的料液开始操作，整个生物分离过程包括材料预处理和固液分离、初步纯化、高度精制和成品制作四大单元操作。分离工艺经过不同批次的条件摸索后，即可用于放大生产。生物分离过程集现代生命科学和工程设计学为一体，重复性强、步骤多、交叉性明显、应用性强。

1 现代生物分离工程综合性实验设计的必要性

生物工程已经作为一级学科列入国务院学位办下发的学科目录，表明现代生物技术在国民经济建设中的作用愈来愈受到重视。生物分离工程（有时也称作生化分离工程，bio－separation）是生化工程的一个重要组成部分，它是描述回收生物产品分离过程原理和方法的一个术语。生化分离工程是生物技术转化为生产力所不可缺少的重要环节，为突出其在生物技术领域中的地位和作用，常称它为生物技术下游加工过程（down－stream processing）。传统上的生物分离工程是作为生物工程或生物技术进入实际应用的必须后续技术之一。最新的发展趋势表明，生物分离工程或将作为现代生物工程的重要研究方向之一，与“细胞培养与代谢工程”、“生物催化与转化工程”、“合成生物技术与系统生物工程”、“生物药物与材料工程”、“生物资源与环境工程”等共同发展。作为重要的工科课程，同时也作为生物工程专业的重要基础课程，关于其理论课的教学探讨已有较多的讨论［3－6］，甚至有学者提出了“研究型”教学的模式［7－8］，但是在其实践环节的综合性实验方面的讨论还有待深入。生物分离工程实验教学是整个教学计划中的有机部分，它具有巩固和加深学生所学的理论知识，使学生获得生产知识、培养学生实际工作能力的功能。学生动手能力的培养不在于一定要发现新的生物分离技术，争创专利，而是学生在现有的知识、能力的基础上，能够创造性地解决问题［9－10］。为提高学生的综合性、工程性创新能力，有必要将相对分散的课程体系提炼出一个系统性强的综合性实验体系，同时也是强化与改革现有的实践教学环节的具体体现。本文将以天花粉蛋白的提取和纯化过程为例，根据现代生物工程的学科特点和实际生产过程中的单元操作安排，设计出从原料提取到纯度鉴定的实验框架。

2 现代生物分离工程设计的理念

现代生物分离工程涉及到很多的分离技术，在设计理念上应该坚持以下原则：

（1）体现系统性。以某一蛋白为模型蛋白，内容包括原材料的预处理技术、破碎技术、初步提取技术、高度纯化（精制）技术、纯度鉴定技术等内容。

（2）工程性。将全部的实验操作完全按照工业生产的单元操作进行划分，分成若干个工艺段。

（3）目标产物明显。通过制得一定量的产物来体现所用的分离技术的可行性，同时也可以提升学生的“成就感”和兴趣。

目前，以水溶性蛋白或酶为目标蛋白的制备过程，是生命科学实验室中最为常见的操作，其中基本上全部用到了最为常见的分离技术，如针对动植物组织的组织破碎或高压压榨技术，实现液固分离的离心技术、过滤技术，可对大体积样品进行快速浓缩并且有初步纯化作用的盐析技术和吸附技术，可对样品进行高度纯化的各种层析技术等。离子交换层析是一种特殊的吸附层析，基本上是一种必不可少的手段。对于蛋白纯度检测来说，尺寸排阻层析和SDS－PAGE（SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳）是2种最为普遍的手段。对终产品的加工技术主要包括超滤浓缩、冷冻干燥技术等。因此，在综合性分离工程实验设计上，应该包括上述全部技术，或至少是绝大部分技术。本文将以传统中药天花粉蛋白为模型蛋白，设计其分离纯化的技术路线。

3 以天花粉蛋白为模型的综合性生物分离工程的实验设计及应用

天花粉是一种传统中药，来自于栝楼的块根，传统上一般用于终止妊娠反应。研究表明，其生物学活性物质是其含有的天花粉蛋白，而且，最近的研究表明，天花粉蛋白具有明显的抗肿瘤作用。该蛋白分子量27kD，pI9.4（pI即等电点，绝大多数蛋白的pI在pH 5.0～9.0范围内）。本文将根据上述原则，以天花粉为原料，提出对其中富含的天花粉蛋白进行提取、分离和纯度鉴定的实验框架［11－13］。

3.1 操作单元1：原料处理

主要操作包括：

（1）原材料的预处理；

（2）天花粉的粉碎及效果评价；

（3）活性炭吸附（脱色处理）。

在原料预处理环节，主要实验内容包括：去除粘附在块根上的泥土、清洗、晾干、去皮及称重、粉碎机（或匀浆机）的多次破碎、大容量低速离心机沉淀未彻底破碎的组织及淀粉粒等、高速冷冻离心机实现较彻底的固液分离以得到真溶液（提取液）、活性炭吸附以脱去色素成分、分光光度计比色方法初步评判破碎效果和所需破碎次数。

需要探索的技术参数包括：

（1）原料与提取液的比例；

（2）破碎次数；

（3）1g活性炭吸附提取液的量或100g原料所需活性炭量（g）；

（4）吸附过程的流速等。

3.2 操作单元2：初步纯化

主要操作包括：

（1）合适盐析条件的确定；

（2）大量提取液的处理——盐析技术；

（3）透析脱盐方法；

（4）冻干处理方法。

在初步纯化环节，主要实验内容包括：利用小体积溶液进行硫酸铵20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%饱和度盐析并配合SDS－PAGE检测，确定盐析技术对天花粉蛋白的初步纯化，同时为实现对大体积提取液的浓缩摸索条件；大量提取液的盐析操作、低温透析操作及冻干操作，以便对高含量比的混合物进行较长时间保存、SDS－PAGE操作。

需要探索的技术参数包括：

（1）合适盐析范围，既保证最大限度地去除杂质，又可在最低盐用量时回收最多的目标蛋白；

（2）比较理想的PAG浓度，以得到理想的电泳图。

3.3 操作单元3：高度纯化（精制）

主要操作包括：

（1）pH阶段梯度洗脱方式的阳离子交换层析；

（2）盐离子线性梯度洗脱方式的阳离子交换层析；

（3）饱和进样时的阶段梯度洗脱方式的阳离子交换层析；

（4）尺寸排阻层析进一步纯化天花粉蛋白。

在高度纯化（精制）环节，主要实验内容包括：根据天花粉蛋白在中性pH条件下带正电荷的性质，在pH 8时进行吸附，可将大部分杂蛋白去除，改变pH再去除pI低于9.4的一些杂蛋白，再用高pH缓冲液洗脱即可得到较纯的目标蛋白溶液。充分使用了目标蛋白pI为9.4的特点。盐离子线性梯度洗脱方式也是一种最为普通的洗脱方式，常用的盐离子浓度范围一般是0～0.5mol/L NaCl。常用的梯度仪有2个形状完全相同，且底部有细管道相连的同水平放置的容器组成，高效液相层析系统则由电脑控制的柱塞泵组成，精确度更高。饱和进样操作也是一种基本操作，可以高效利用层析系统。尺寸排阻层析既是一种最后的纯化手段，也是一种纯度鉴定技术，操作过程相对简单些。

需要探索的技术参数包括：

（1）合适的pH梯度；

（2）在给定层析柱条件下，盐梯度洗脱时的体积及洗脱速度；

（3）尺寸排阻层析的进样量及洗脱速度等。

3.4 操作单元4：成品加工

主要操作包括：

（1）超滤浓缩；

（2）冰冻干燥处理。

在对末端产物的加工环节，主要实验内容包括：

（1）利用超滤浓缩技术对大体积的含有目标产物的溶液进行浓缩，达到合适的浓度；

（2）利用冰冻干燥机对上述样品进行冻干并分装保存。

需要探索的技术参数包括：

（1）在选定截留一定分子量蛋白的超滤后，探索合适的过膜压力和浓缩倍数；

（2）在给定容器和样品体积条件下，探索冻干所需的大致时间。

3.5 操作单元5：纯度鉴定

主要操作包括：

（1）分析型尺寸排阻层析技术；

（2）SDS－PAGE方法。

在纯度鉴定环节，主要实验内容包括：

（1）分析性尺寸排阻层析对目标样品的分析，根据出峰情况初步断定样品的纯度，该操作需要用到高效液相层析系统；

（2）利用SDS－PAGE方法检测样品中蛋白单体/亚基的组成，该操作是普通生物化学实验室里的常规操作，通过与分析性尺寸排阻层析的比较来断定样品的纯度。

需要探索的技术参数包括：

（1）给定尺寸排阻层析柱时，不同的流动相的选择以及进样体积的范围；

（2）SDS－PAGE操作时，合适的凝胶浓度。

根据上述操作，需要得到的结果汇总到简表（表1）中，以指示实验进度。

表1 不同操作环节的蛋白回收情况比较（空白表）

3.6 应用

我们将上述实验设计的内容作为我校2010级和2011级研究生课程“高等生物分离工程”的实验部分，选课学生包括“化学工程与技术”学科及“生物学”学科的100多位硕士研究生（含少量博士生），加深了学生对现代生物分离工程系统性、工程性的认识，取得了预期的训练效果。

4 结束语

通过生物分离工程综合性实验的设计和在我校2010级和2011级相关专业研究生的具体实践，达到了我们的预期目标，同时在实践中也对具体的实验过程进行了完善。这项工作的进一步改进，将会更加有利于生物工程类研究生（含本科生）的教育教学。

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