植物激素对灵菊七愈伤组织中黄酮含量的影响

范三微等

摘要：以灵菊七（Gynura medica）无菌试管苗叶片为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织，并进行愈伤组织继代培养。将继代培养的愈伤组织接种于含有不同激素（浓度）组合的愈伤增殖培养基上，以硝酸铝显色法测定其中黄酮的含量。结果表明，在4种愈伤组织增殖培养基上，愈伤组织中总黄酮含量最大值分别达到0.794%、2.112%、1.652%、2.792%。培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L GA最适用于灵菊七愈伤组织中黄酮总量的积累。

关键词：灵菊七（Gynura medica）；愈伤组织；植物激素；黄酮

中图分类号：S567；Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1450-03

药用植物灵菊七（Gynura medica）俗名仙草、长寿草，其在中国福建地区具有丰富资源，在浙江、江苏、安徽等省区也有种植，民间采其植株茎、叶泡茶饮用来防治糖尿病已有较长的历史。黄酮类化合物广泛存在植物体内，具有多种生理功能，是多种中药发挥生理作用的物质基础[1-3]。国内学者对灵菊七的提取物生物活性研究证明灵菊七含有的黄酮类、酚类物质具有抗氧化活性[4]；灵菊七的水、醇提物对糖尿病大鼠有显著治疗作用[5，6]，这些研究显示出灵菊七具有广阔的降血糖药用开发前景。

该研究以灵菊七叶片为外植体诱导形成愈伤组织，通过调整培养基中激素种类与浓度，促进愈伤组织合成黄酮类物质，为生物转化法生产灵菊七黄酮提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灵菊七植株采自安徽省六安市，经安徽师范大学周守标教授鉴定为Gynura medica Y. K. Yang et J.K.Wu，以此为母本开展组织培养研究，并获得了大量的灵菊七试管苗，以此试管苗作为试验材料[7]。

1.2 试验仪器与试剂

MLS-3780型高压蒸汽灭菌器购自日本Sanyo Industry公司；BCM-1000型生物净化工作台购自苏州净化设备有限公司；SPX智能型生化培养箱及PQX型多段智能人工气候箱购自宁波江南仪器厂；R-205型旋转蒸发仪购自上海申胜生物技术有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵购自郑州长城科工贸有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司。

盐酸、亚硝酸钠、乙醇、硝酸铝等试验试剂均为国产分析纯；玉米素（ZT）、α-萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、赤霉素（GA）等植物激素及琼脂均为国产生物试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 愈伤组织的诱导培养 以MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA为愈伤组织诱导培养基，调节pH至6.0，常规灭菌。取无菌试管苗叶片，切成面积约1 cm2的小块，每个培养皿接种10块。置于人工气候箱中（光照周期12 h，26 ℃，2 000 lx）进行愈伤组织的诱导培养，接种后每天观察愈伤组织诱导情况。

1.3.2 愈伤组织中黄酮的增殖培养 将愈伤组织进行多次继代培养，每次继代培养周期为12 d。按2.0 g/瓶，把愈伤组织分别接种于不同激素组合的固体增殖培养基（表1）上（40 mL/100 mL三角瓶），通过检测愈伤组织中黄酮含量考察不同激素对愈伤组织中黄酮生物合成的影响。置于人工气候箱中（培养条件同诱导培养），接种后每2 d取样一次，测定细胞增长量、总黄酮含量（均以干重计）。

1.3.3 芦丁溶液标准曲线回归方程的建立 精确配制0.1 mg/mL的芦丁标准溶液，6个10 mL容量瓶中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准溶液，再分别加入体积分数70%的乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入质量分数10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，再用蒸馏水定容，摇匀后放置15 min，于510 nm波长处测定其吸光度，绘制标准曲线。

1.3.4 愈伤组织中总黄酮的提取及含量测定 称取适量愈伤组织，按料液比1∶30加入体积分数70%的乙醇溶液，50 ℃水浴回流2 h，过滤后将滤液旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，再用体积分数70%的乙醇溶液准确定容。按“1.3.3”中方法检测愈伤组织中总黄酮的含量并进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 灵菊七愈伤组织的诱导

取灵菊七无菌试管苗叶片（图1），接种在培养基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，进行愈伤组织的诱导。ZT显示出了强烈的促进作用，在叶片组织块接种后第9天，愈伤组织诱导率达到84.4%，第14天时达到100.0%，愈伤组织呈白色疏松状（图2）。

2.2 芦丁溶液标准曲线回归方程的建立

配制芦丁标准溶液，按标准曲线测定的方法测定愈伤组织中总黄酮含量。以10 mL溶液中芦丁标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线[8，9]。计算芦丁标准曲线回归方程得：y=6.686 29x+0.004 17，相关系数r=0.999 5，说明在0～0.5 mg/10 mL范围内线性关系良好。

2.3 不同植物激素对灵菊七愈伤组织中黄酮生物合成的影响结果

表1中设计了4种影响愈伤组织中黄酮生物合成的增殖培养基，其中1号与2号培养基的激素种类一致，但6-BA的浓度不一致；3号与4号培养基的激素种类不同，但各种激素的浓度一致。

按“1.3.2”中的方法计算细胞增长量。愈伤组织在不同激素组合的培养基上的生长情况见图3。由图3可知，愈伤组织快速生长期集中在接种后的10～26 d，随后愈伤组织生长进入停滞期。比较愈伤组织在各培养基上的生长量，4组之间愈伤组织生长量虽有差异，但未达显著性水平（P>0.05）。

在不同激素增殖培养基上培养时，灵菊七愈伤组织中总黄酮含量的变化情况见图4。由图4可知，灵菊七愈伤组织中黄酮大量积累的时间出现在接种后的18～36 d，第36天后愈伤组织中总黄酮的积累进入停滞期；黄酮积累量从高到低的培养基编号是4、2、3、1。

愈伤组织经过40 d的继代培养，呈现出不同深浅的颜色，结果见图5。从图5可以看出，1号培养基上的愈伤组织主要呈白色，褐化不明显（A）；2号培养基上的愈伤组织呈浅绿色，无褐化（B）；3号培养基上的愈伤组织主要呈黄绿色，褐化比较明显（C）；4号培养基上的愈伤组织为较深的绿色，少部分褐化（D）。

虽然愈伤组织的生长量各培养基间无显著性差异，但其中黄酮的含量则有差异，结果见表2。由表2可知，呈白色的愈伤组织黄酮含量为0.794%，而呈绿色的愈伤组织中黄酮含量达2.792%，1号培养基的愈伤组织黄酮含量极显著低于2、3、4号培养基上的愈伤组织（P<0.01），3号培养基的愈伤组织黄酮含量也低于2、4号培养基的。

3 小结与讨论

本研究以灵菊七叶片为外植体诱导形成愈伤组织，并接种于4种不同的增殖培养基上，以获得黄酮为目的进行培养。本课题组对灵菊七愈伤悬浮培养的研究发现，在细胞对数生长期时细胞内有大量糖类物质的积累[10]，而黄酮含量非常低。细胞对数生长期时愈伤组织中黄酮的积累也处于较低的水平，而细胞干重持续增加，可能是由于细胞糖类、蛋白类物质积累产生的结果。灵菊七愈伤组织中黄酮大量合成是在细胞进入对数生长期以后，当细胞生长处于停滞期时愈伤组织中黄酮的生物合成非常旺盛，并达到最大积累量。黄酮是植物的次生代谢产物之一，其生物合成的起始底物为香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A[11]。植物细胞内乙酰辅酶A来源于糖类代谢，因此愈伤组织中干物质的积累有利于黄酮的生物合成。

本研究中愈伤组织增殖培养前所有的愈伤组织均培养在培养基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，因此接种于不同增殖培养基上的愈伤组织中黄酮含量无差异，而经过40 d的继代培养，愈伤组织中黄酮类的积累量之间呈现出差异（表2）。1、2号培养基中激素种类相同，组激素浓度不同。当6-BA∶NAA=1时，愈伤组织中黄酮最大积累量为0.794%；当6-BA∶NAA=4时，愈伤组织中黄酮最大积累量（2.112%），表明6-BA浓度高于NAA浓度时有利于愈伤组织中黄酮类的生物合成。3、4号培养基中激素种类不同，各激素浓度相同，3号培养基上愈伤组织中黄酮最大积累明显低于4号培养基上的愈伤组织，表明GA促进黄酮生物合成的作用比KT强。综上分析表明，灵菊七细胞内黄酮生物合成受激素浓度和激素种类的影响。有研究报道菊三七属植物红凤菜（Gynura bicolor）花色素的生物合成受茉莉酮酸酯诱导而在根中合成，进一步研究发现处理红凤菜的组培苗根，茉莉酮酸酯诱导了调控类黄酮生物合成基因GbMYB1、GbMYC1的协同表达，造成花色素在根中的积累[12，13]。花色素和黄酮都是类黄酮化物之一，生物合成花色素的前体也是黄酮生物合成的前体。灵菊七与红凤菜都是菊三七属植物，并且都能合成紫色的色素，因此推测与黄酮类生物合成有相似的机理。究竟是何种激素对灵菊七黄酮生物合成发挥调控作用，有待于进一步的研究。

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