痹痛康丸对胶原诱导性关节炎大鼠IL—1β、IL—6的影响

闫美凤 姜楠 徐明智 吕新亮

【摘 要】目的：观察痹痛康丸对胶原诱导性关节炎大鼠踝关节滑膜白细胞介素-1β、白细胞介素-6的影响，探讨其治疗作用机制。方法：建立II型胶原加完全弗氏佐剂诱导的大鼠胶原诱导性关节炎模型，将60只Wistar大鼠随机分为6组。痹痛康丸低、中、高剂量组（0.3，3，30 g·kg-1·d-1），甲氨蝶呤组（每周1.2 mg·kg-1），以上各组药物溶解于2 mL生理盐水中，每日1次，连续灌胃给药4周。空白对照组及模型组灌服生理盐水，每只2 mL。8周后处死大鼠，观察右踝关节滑膜病理改变情况及关节滑膜中白细胞介素-1β、白细胞介素-6蛋白表达量的变化。结果：各用药组除痹痛康丸低剂量组外，滑膜组织的病理改变均有不同程度的减轻，白细胞介素-1β、白细胞介素-6蛋白的表达量较模型组降低（P<0.05）。结论：痹痛康丸能有效降低胶原诱导性关节炎大鼠滑膜炎程度，防止骨破坏或关节重构，有免疫调节作用。

【关键词】 关节炎，胶原诱导性；痹痛康丸；白细胞介素-1β；白细胞介素-6；实验研究；大鼠

Effect of Bitongkang Pill on Interleukin-1β and Interleukin-6 in the Collagen-Induced Arthritis Rats

Yan Mei-feng，Jiang Nan，Xu Ming-zhi，Lü Xin-liang

【ABSTRACT】Objective：To investigate the impact of Bitongkang Pill on the ankle joint synovium IL-1β and IL-6 of collagen-induced arthritis （CIA） rats，exploring its therapeutic mechanism.Methods：After establishing the CIA rat models with type II collagen and complete Freund's adjuvant，60 Wistar rats were randomly divided into 6 groups：the control group，the model group，the three bitongkang pill groups [with low，medium and high dose—0.3，3，30 g （kg·d） -1] and the methotrexate group [1.2 mg （kg·w） -1].Drugs of the above groups were dissolved in physiological saline （2 mL） and the rats were continuously given drugs by intragastric administration one time per day for four weeks.Rats of the control group and the model group were given normal physiological saline，2 mL for each.After 8 weeks，the rats were sacrificed to observe the pathological changes of the right ankle joint synovium and the expression changes of the IL-1β，IL-6 proteins in synovium.Results：The pathological changes of synovial tissue of every treatment group but the group with the low-dose bitongkang pill was relieved，and the IL-1β，IL-6 protein expressions were lower than that of the model group （P < 0.05）.Conclusion：Bitongkang pill can effectively relieve the synovitis of CIA rats and prevent bone destruction or joint reconstruction，having immunomodulatory effect.

【Key words】 arthritis，collagen-induced；bitongkang pill；interleukin-1β；interleukin-6；experimental study；rats

類风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性自身免疫性疾病，主要病理改变为关节滑膜炎症、渗液、细胞增殖、血管翳形成，软骨及骨组织破坏，导致关节破坏和功能障碍。临床和实验研究已证实痹痛康丸有抗炎、镇痛和免疫调节作用，并能有效控制RA病情进展[1，3-5]。本实验旨在研究痹痛康丸对胶原诱导性关节炎（Collagen-induced Arthritis，CIA）大鼠踝关节滑膜中白细胞介素–1β（IL–1β）、白细胞介素–6（IL–6）蛋白表达量的影响，进一步探讨其治疗RA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠60只，由内蒙古大学动物试验中心提供，动物许可证号：SCXK（蒙）2002-0001，雌雄各半，体质量（190±10） g，

分笼饲养。

1.2 实验药品、试剂及仪器 痹痛康丸由武警内蒙古总队医院制剂室提供（[2003]武制FP030001），甲氨蝶呤（MTX）（国药准字H31020644）。牛Ⅱ型胶原蛋白（c7806-10 mg，SIGMA公司生产，批号1000638705），弗氏完全佐剂（F5881-10 mL，SIGMA公司生产），鼠抗人IL-1β单克隆抗体（批号DZE90065，购于北京博奥森公司），鼠抗人IL-6免疫组化单克隆抗体（批号DZE90066，购于北京博奥森公司）。FR-988生物显微图像分析仪（上海复日科技有限公司制造），电子分析天平TB-2002 DENVER（北京赛多利斯仪器系统有限公司生产），切片机 LEICA RM 2016（上海企伟实业有限公司生产）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的建立[1] 将牛Ⅱ型胶原蛋白溶解于0.1 mol·L-1醋酸中，制成2 mg·mL-1溶液，将溶液与弗氏完全佐剂按1∶1比例制成乳剂。在各组大鼠尾根部、右足足垫皮下各注射1个部位，每只每次0.1 mL；3周后采用同样方法再次进行免疫注射，每只每次0.2 mL [1，3，5-6]。4周后模型造成。根据关节红肿程度进行关节炎指数（Arthritic Index，AI）[2]的评定。关节积分评定每周2次，全身病变按5级评分法评价，4个肢体的病变程度累计积分，计算AI。积分越高，表示关节症状越重。每只大鼠最高16分，造模的大鼠AI≥4分认为造模成功。4周后再通过苏木精-伊红（Hematoxylineosin staining，HE）染色观察大鼠右踝关节滑膜病理改变，根据AI及病理改变情况确定CIA模型大鼠造模成功。本实验造模60只大鼠全部成功，成功率达到100%。

2.2 实验分组 60只大鼠随机分为空白对照组，模型组，痹痛康丸低、中、高剂量组，MTX组，每组10只，雌雄各5只。

2.3 给药方法 空白对照组与模型组：无药物干预，第5周开始灌服生理盐水，每只2 mL，每日1次，连续给药4周。痹痛康丸低、中、高剂量组和MTX组均在第5周开始给药，每日1次。痹痛康丸低剂量组灌服0.3 g·kg-1·d-1，中剂量组为

3 g·kg-1·d-1（约为临床人体用量的10倍），高剂量组为30 g·kg-1·d-1，MTX组每周1.2 mg·kg-1（约为人体用量每周10 mg）。以上各组药物溶解于2 mL生理盐水中，各组连续给药4周。其中MTX组每周灌服MTX溶液1次，其余6 d自由饮食。人与大鼠剂量转换按如下公式：D=D'×R/ R'×（W'/W）1/3。

D，D'分别是两种动物的每公斤体质量给药剂量；R，R'分别是两种动物的体质量系数，大鼠和人的值分别为90和100；W，W'分别是两种动物的体质量。

2.4 IL-1β、IL-6蛋白表达量检测方法 给药4周后，采取大鼠心脏血每只约2 mL，处死大鼠，将血液静置30 min后离心 10 min，分离血清；大鼠处死后，取右踝关节组织固定、包埋。组织切片制作采用HE染色，IL-1β、IL-6蛋白表达检测采用免疫组化SP法。在IL-1β、IL-6表达检测过程中，每个染色流程均有对照作为质量控制标准，阳性对照采用阳性组织切片，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。每张免疫组化切片置于低倍镜（×100）下随机选取5个视野，采用Smartscape图像分析系统分析所有图像，采用平均灰度值反映IL-1β、IL-6蛋白在组织中的表达强弱。

2.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据用表示，组间比较采用单因素方差分析进行统计处理，检验水准α=0.05，以P<0.05

为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠踝关节病理改变 从大鼠踝关节病理切片中可见，模型组滑膜组织出现大量炎性细胞浸润，滑膜细胞变圆，滑膜增厚，并有明显骨破坏和小血管增生。各用药组除痹痛康丸低剂量组外均较模型组病理改变有不同程度的减轻，痹痛康丸低剂量组滑膜组织与模型组比较未见明显变化。痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节滑膜细胞形态逐渐恢复正常，滑膜厚度趋于正常，小血管增生较模型组和痹痛康丸低剂量组明显减少，未见明显骨破坏。

3.2 各组大鼠踝关节滑膜IL-1β、IL-6蛋白表达量的变化 阴性对照切片上踝关节滑膜组织未见IL-1β、IL-6蛋白阳性表达，其他各组切片可见IL-1β、IL-6蛋白免疫反应阳性的棕黄色颗粒，定位于细胞质。与空白对照组比较，模型组大鼠踝关节IL-1β、IL-6蛋白表达显著降低（P<0.05），痹痛康丸中、高剂量组、MTX组IL-1β、IL-6蛋白表达与模型组相比显著升高

（P<0.05），痹痛康丸低剂量组大鼠滑膜IL-1β、IL-6蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义

（P>0.05），痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节IL-1β蛋白表达与MTX组比较，差异无统计学意义

（P>0.05）。痹痛康丸中剂量组大鼠踝关节IL-6蛋白表达与MTX组比较，差异无统计学意义（P>0.05），

痹痛康丸高剂量组大鼠踝关节IL-6蛋白表达低于痹痛康丸中剂量组、MTX组，差异有统计学意义（P<0.05），

见表1。

4 讨 论

RA属中医学“痹证”“历节”等范畴。因患者先天不足、正气虚弱，风、寒、湿、热等外邪侵袭，致机体气血、肝肾亏虚，痰浊瘀血阻络，临床以关节、肌肉、筋骨疼痛、肿胀、麻木，关节屈伸不利、甚至关节僵硬畸形为主要表现。痹痛康丸方中鹿角霜、熟地黄等益肾填精以固其本，制附子、桂枝等温经散寒、通经止痛，羌独活、蜈蚣、乌梢蛇、地龙等祛风胜湿、搜风活血，薏苡仁、防己利湿消肿，黄芪益气，赤芍活血，白芍、生地黄养阴缓急并防桂附等辛热之药燥血。上述诸药配合攻不伤正，补不碍邪，处方平稳，适合RA患者长期服用。前期实验[1，6]表明，痹痛康丸能明显改善CIA大鼠症状，减轻大鼠胸腺和脾脏重量，减轻或抑制关节滑膜炎症，具有减轻或消除关节肿胀的作用；可使大鼠血清CD4+、CD8+比值降低，并可抑制大鼠踝关节滑膜内皮细胞生长因子、转化生长因子的表达，提示痹痛康丸能有效抑制滑膜中新生血管的形成。CIA为非感染性炎症，病理变化为增生性滑膜炎、关节软骨破坏等，MTX 可使体外培养滑膜细胞中IL-1诱导产生COX-2减少，但对COX-1、

COX-2的mRNA表达无直接影响；抑制RA患者滑膜组织中中性粒细胞的趋化性，使炎症关节处的COX進一步降低，而且MTX可抑制前炎症因子TNF的表达[7]，因此，MTX对CIA有治疗作用。

在RA滑膜增生與关节破坏的过程中，IL-1β是其中起着重要作用的细胞因子，关节组织中主要由滑膜细胞软骨细胞分泌、由巨噬/单核细胞产生，在RA炎症反应和组织损伤中发挥重要作用。在RA致病过程中，IL-1β可促使细胞表面分子在成骨细胞或骨衬里细胞中的表达，正是表面分子的表达促使了以上变化的发生。IL-1常由局部免疫复合物与游离胶原等分解产物刺激产生，进而促使滑膜和软骨细胞生成基质金属蛋白酶，导致滑膜炎和软骨基质成分的降解破坏，此过程反复继而形成恶性循环[8-9]。此外，IL-1β可通过与成骨细胞部分受体结合，增加核因子-κβ受体激活因子配体的表达，刺激大量炎性因子IL-6和IL-8分泌产生，这两个因子与RA血管翳的生成以及关节软骨侵蚀密切相关。大量动物实验及文献报道证实，细胞因子网络失衡紊乱导致RA关节破坏和滑膜炎症，IL-1β和TNF-α在RA发病机制过程中起关键作用，IL-1β可刺激基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs）产生，同时抑制胶原和糖蛋白合成，这说明了IL-1β有加重骨损伤的作用，且有研究显示TNF-α有类似作用，但作用不及IL-1β强烈[8]。IL-6是一种多效的细胞因子，曾被称为B细胞分化生长因子，能刺激B细胞成熟，促进RF和其他自身抗体的产生。在炎性细胞因子网络和免疫调节网络具有关键性且多样的作用。IL-6可强力诱导产生急性期反应蛋白（如C-反应蛋白）诱导B细胞分化为能分泌IgG型抗体的浆细胞，介导前列腺素类因子的生成，促进IL-1、肿瘤坏死因子（TNF）和类风湿因子的分泌[10]。IL-6不仅是重要的致炎细胞因子，且参与骨关节重建过程中的细胞间相互作用。在RA发病过程中，IL-6可以通过提高成骨细胞和滑膜细胞中细胞核因子κB活化因子配体的释放，促进破骨细胞生成因子的表达。体外实验证明，IL-6既能激活B细胞促进自身抗体产生，又能通过诱导IL-2的产生和IL-2R的表达而活化T细胞，并可与IL-2结合，促使T细胞和胸腺细胞分化为细胞毒性T细胞，其分泌的炎性CK如IL-1β、TNF-α、IL-6和RA的滑膜炎高度相关[10-11] 。

在RA发病进程中，IL-6与TGF-β共存在并发挥协同作用，诱导大量Th17细胞形成。由Th17分泌的强致炎性细胞因子IL-17与TNF-α协同诱导IL-6高表达，诱导破骨细胞和FLS分泌MMPs，激活破骨细胞降解结缔组织，加剧骨侵蚀[11-12]。本实验研究结果表明，IL-1β、IL-6在模型组大鼠踝关节中的表达明显高于痹痛康丸中、高剂量组，且痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节IL-1β表达与MTX组比较无差异，说明痹痛康丸能有效降低关节组织对IL-1β的分泌。痹痛康丸高剂量组IL-6表达量低于MTX组，说明痹痛康丸还能有效降低关节组织对IL-6的分泌。

本研究发现，痹痛康丸具有降低CIA大鼠关节组织对IL-1β、IL-6的分泌，抑制CIA大鼠滑膜炎症、血管翳生成，延缓骨破坏的作用。相信随着痹痛康丸对RA治疗作用的深入研究，能为RA的有效防治开辟新的途径。

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