葫芦科作物功能基因组学研究进展

赵胜杰　路绪强　朱红菊等

摘 要： 近些年，植物基因组学研究发展迅速，已进入功能基因组研究的新阶段，一些新的技术和方法不断涌现。西瓜、甜瓜和黄瓜是葫芦科重要的经济作物，其功能基因组学研究虽然起步较晚，但也取得了初步成果。综述了近几年植物功能基因组学主要研究方法如表达序列标签（EST）、TILLING技术、DNA芯片和RNA干涉（RNAi）等在西瓜、甜瓜和黄瓜上的应用概况，并展望了未来葫芦科作物功能基因组研究的发展趋势。

关键词： 功能基因组； 西瓜； 甜瓜； 黄瓜

功能基因组学（functional genomics），又被称为后基因组学（post-genomics），它是利用结构基因组学提供的丰富信息和产物，借助高通量、大规模的试验分析方法，在全基因组或系统水平上研究基因的功能，弄清生物体中各组分是如何工作并形成有功能的细胞、组织及整个生物体[1]。其目标是明确基因组中全部基因的功能， 揭示植物生长发育、环境应答互作的分子网络， 从而全面阐释植物的生物学基础。目前，水稻、拟南芥等模式植物功能基因组学研究发展较快，近几年随着科技进步和资金投入的不断增加，葫芦科作物基因组研究也取得了一定的成果。西瓜基因组全长约425 Mb，甜瓜约450 Mb，黄瓜约376 Mb[2]， 基因组大小比较适合开展基因组测序和功能基因组研究。2007年由西班牙牵头组织，美国、中国、法国、以色列、日本等国家的14个实验室联合启动了国际葫芦科基因组计划（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），该计划为瓜类蔬菜的基因组学研究奠定了良好的技术平台。在此基础上，2008年相继启动了葫芦科三大作物西瓜、甜瓜、黄瓜的全基因组测序计划[3]。随着基因组测序工作的陆续完成，瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。本文综述了近些年植物功能基因组学主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黄瓜上的应用概况。

1 高通量、大规模EST测序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通过对cDNA 文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA 的5或3端序列，长度一般为150～500 bp。EST是基因编码序列的一部分，通过与数据库中已知功能的基因序列进行对比，从理论上可推测其基因功能。EST已发展成为新基因发现的有效途径，也是植物功能基因组学研究的重要工具。随着测序技术的不断改良和测序成本的降低，高通量、大规模EST测序及功能解析开始广泛应用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通过与叶片cDNA消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36 d）果肉消减cDNA文库，获得了832条无冗余EST，序列比对分析表明有410个EST-unigenes与已知编码蛋白的基因同源，按功能归类分属于初级代谢、氨基酸合成组装、细胞膜运输、细胞分裂、细胞壁代谢、细胞骨架和细胞形成、基因转录和表达、信号转导、抗性防御和次级代谢。这些潜在的功能基因序列为日后开展西瓜果实发育和品质形成的遗传与功能基因组研究奠定了基础。吕桂云等[5]通过构建枯萎病菌诱导的西瓜根系组织SSH-cDNA文库，对测序获得的4 431条高质量EST序列进行聚类拼接，获得1 756个非重复序列，基因功能分类表明抗病与防御相关基因约占36.3%，对获得的西瓜与枯萎病非亲和互作中部分特异性表达的基因进行了初步探讨，发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因及茉莉酸和木质素2个主要代谢途径。Guo等[6]采用Roche/454新一代测序技术，从西瓜4个果实发育期（授粉后10、18、26、34 d）获得了577 023个高质量EST，组装成了75 068个unigenes，有54.9% 的unigenes与GeneBank中的已知基因同源，其中2/3来源于黄瓜。Gene Ontology （GO）注释表明，有33 853个unigenes（45.1%）获得至少1个GO术语，被注释序列的基因功能分属于分子功能（molecular function）类别、生物过程（biological process）类别和细胞组分（cellular component）类别，所占比例分别为38.6%、38.6%和36%，另外大约29%的unigenes同时具有以上3种功能分类。生物过程类别的基因主要参与细胞过程、代谢过程和生物合成过程，表明果肉组织在发育过程中发生了广泛的代谢活动。数字基因表达谱分析及实时定量PCR验证表明有3 023个基因在果实发育不同时期存在显著的表达差异，表达量差异至少在2倍以上。研究发现细胞壁相关基因在未成熟白瓤果肉组织中高效表达，而类葫芦卜素代谢基因（八氢番茄红素合成酶和番茄红素-β环化酶）、蔗糖代谢基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果实发育不同时期差异表达明显，作者对与果实品质相关的一些生化途径如纤维素合成、木栓质合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等进行了进一步鉴定。

甜瓜大规模EST测序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通过构建甜瓜EST数据库，从4 800条序列中鉴定出与甜瓜果实香味代谢相关的3类基因家族，乙醇乙酰转移酶、倍半萜合酶和类胡萝卜素裂解双加氧酶，克隆得到候选基因的全长序列，研究了这些基因在不同甜瓜品种间的表达模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通过对8个来源于甜瓜不同组织和生理状态的cDNA文库（包括授粉后15 d和46 d的2个果实的文库）测序和序列拼接、组装，获得16 637个无冗余EST。通过与拟南芥基因组做生物信息学比对分析，发现众多个与果实发育相关的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、细胞壁代谢酶、类胡萝卜素合成代谢酶、MADS-box 基因等。实时定量PCR表明在果实成熟期乙烯受体基因EIN4表达量翻倍，表明该基因与果实成熟期乙烯信号调控相关。MADS-box 基因SVP在果实成熟期表达量下降了4倍，番茄红素ε环化酶基因（LUT2）和木葡聚糖内糖基转移酶基因（TCH4）表达量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]构建了4个不同类型甜瓜品种不同植物组织的11个全长cDNA文库和4个标准化cDNA文库，分别获得71 577 条和22 179条EST，能够组装成24 444条unigenes，基因对比显示有75%～85%的序列与双子叶植物同源，70%与单子叶植物同源，有6 972个基因家族在双子叶植物和单子叶植物间具有保守性。对数字基因表达谱研究，结果表明有175个基因为组织特异表达，这些基因为未来开展功能基因组研究提供了宝贵的资源。作者从这些序列中鉴定出了4 068个SSR和3 073个SNP，并对1 382个全长转录组进行了分析。为了解甜瓜对盐胁迫的抗性反应机制，Shiwei Wei等[10]构建了耐盐甜瓜品种根系组织的抑制消减杂交（SSH）cDNA文库，测序获得262条uni-ESTs，有161条序列与已知基因高度同源，128条与未知功能基因同源，有很多基因显示与生物和非生物胁迫相关。研究表明，甜瓜耐盐受众多蛋白质调控，这些蛋白涉及细胞代谢、能量、转录、信号转导、蛋白质命运以及细胞拯救和防御等生物过程，表明甜瓜作物耐盐存在复杂的抗性反应机制。

在黄瓜上面，Dae-Jae Kim[11]构建了黄瓜子叶生长不同时期的cDNA文库，筛选出大量与衰老相关的基因，利用半定量RT-PCR分析了365个克隆，发现有很多基因表达量提高，这些基因有些功能已知，有些功能未知。齐晓花等[12]采用SMART 技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508 的叶片cDNA文库，利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5端进行单向测序，共获得8 035个有效的ESTs，序列的平均长度为838 bp。从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因，约占unigene总数的72.5%，1 991个unigenes 获得分子功能注释，其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%；在获得功能注释的unigene 中，有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达，其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建黄瓜胚胎发育早期和晚期差异表达cDNA文库，经反向Northern blot杂交检测，共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接，共得到93个Uni-ESTs，其中包括86个singletons 和7个contigs。将上述EST序列在GenBank上进行BLAST比对，有83个EST片段找到了与之匹配的同源序列，有10 个EST片段未找到同源序列，推测可能是新基因。其中很多EST与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列进行功能分类，发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置，而在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黄瓜全雌系和雌雄同株系测序获得353 941条EST，其中188 255条来源于全雌花，165 686条来源于雌雄花，结合5 600条GeneBank收录的EST和mRNA序列，组装成了81 401条unigenes。通过基因功能注释和分析，预测了343个生化代谢途径。对数字基因表达分析，表明大约200个基因在不同花性型存在差异表达，为研究植物花分化的分子机理提供了新的认识。潘宇等[15]构建了黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织cDNA文库，测序获得116条EST，92.2% 的长度在400 bp以上，19% 为重叠序列。在GeneBank中进行BLAST分析后确认与已知功能基因相似的EST序列有71条，有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技术

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向诱导基因组局部突变技术），该技术借助高通量、标准化的检测手段，快速有效地从经化学诱变剂（EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。与传统的插入突变比，TILLING技术利用传统的化学诱变获得突变体，不需要耗时的转基因和复杂的组织培养过程，具有高通量、低成本、高效率等诸多优势。目前，TILLING作为一种全新的反向遗传学研究方法已经用于多种植物。

TILLING技术在葫芦科作物上的应用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS诱变构建了甜瓜品种Noy Yizreel的突变基因库，共产生3 000个M2家系，发现了大量新的表型突变，大部分为隐性单基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品种Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技术平台，CharMono系雌雄同株、呼吸跃变型，在M2代发现了大量子叶、茎蔓、花和果实发生的表型突变，利用与果实品质相关的11个基因筛选突变株系，发现大约每隔573 kb会发生一个突变，大部分都是G/C 突变成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的变异，外显子测序表明31.3%为基因沉默突变，65.1%为错义，2.4%为转录终止，1.2%为拼接剪接突变，氨基环丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1筛选到7个独立的点突变，其中G194D果皮颜色变异明显，果实延迟成熟黄化，而果形、可溶性固形物含量和果肉颜色仍然与野生型一样。G194D自交纯合株系也呈现出果实发育期延长、果肉变硬和果实延熟，并且在2个不同试验地点表现一致，这些表型变异证明了G194D系CmACO1基因突变而来，该研究利用TILLING技术成功创造了甜瓜品质新资源，显著提高了品种货架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品种Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技术平台，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸跃变型，EMS诱变得到2 368个M2家系，用病毒侵染抗性相关的2个基因Cm-eIF4E（核细胞翻译起始因子）、eIF（iso）4E（核细胞翻译起始因子异构体）、4个与果实成熟相关的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脱氧羧腐胺赖氨酸合酶）以及PDS（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现有4个Cm-eIF4E等位基因突变，推测其中的2个改变了蛋白质功能，PDS有2个等位突变，发生在外显子的突变改变了蛋白质功能，造成了苗期白化表型突变。4个与果实成熟相关的基因在群体中筛选突变，得到8个突变的家系。徐美红等[19]用PCR产物直接测序和克隆测序2种方法用于检测这8个突变家系的碱基变化。在直接测序中，4个突变家系的测序结果清晰，能够确认碱基的变化；其他4个家系的结果不清晰，不能确认碱基的改变。在克隆测序中，8个家系的测序结果均清晰，能够直接确定目的基因的点突变。在2种方法的比较中，克隆测序的准确率、效率明显优于直接测序法。

黄瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通过EMS诱变获得了大约1 000个M2家系，在苗期发现了诸如植株矮化、子叶自发病变、黄（花）叶、白化苗、叶片卷曲、窄型黑色子叶等诸多表型突变，利用PDS-3（八氢番茄红素去饱和酶）筛选突变株系，发现了4个突变家系，测序表明碱基突变均发生于基因内含子区域，因此并未造成相应的黄化表型突变。该套突变体库为黄瓜反向遗传学及基因功能研究奠定了很好的基础。

西瓜作物TILLING技术的应用尚未见正式报道，美国农业部蔬菜研究实验室的科学家目前正在从事相关的工作，预计将很快取得进展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因组序列，或来自未知序列的 cDNA 克隆制备模板 cDNA，通过人工或特定的仪器将大量模板 cDNA 按设计好的顺序定量地固定在载体上制备成高密度的微阵列。将标记好的样品 cDNA 片段（来自不同细胞、组织或整个器官）与模板上的cDNA 进行分子杂交。根据不同材料间基因差异表达的信息，推论某个基因的功能或鉴定和分离目的基因。DNA 芯片还广泛应用于基因表达谱、突变基因筛选和转基因鉴别等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通过与叶片cDNA消减杂交构建了西瓜果实发育不同时期（授粉后12、24、36 d）果肉消减cDNA文库。为进一步探究这些EST-unigenes在果实发育不同时期的转录表达差异，W. Patrick Wechter等[21]利用微列阵（microarray）技术对这些EST进行了差异表达分析，发现与叶片相比，有335个ESTs的表达存在明显的差异，表达量差异至少在2倍以上。其中有211个与已知功能基因同源，96个为未知基因。这些基因参与了维管系统、类胡萝卜素合成、转录调控、病原和逆境胁迫响应以及乙烯合成等，实时定量PCR也验证了这些功能基因的差异表达。

在甜瓜上，张红等[22]利用国内首个甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0检测了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果实基因表达以及经60Co射线辐射诱变后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病变异株成熟果实基因的表达。结果显示，该芯片平均能够检测新疆厚皮甜瓜基因2 008个，检测出的基因占该芯片基因探针总数的65.4%。发现酸味抗病变异株上调表达的基因有251个，占检出基因总数的12.5%，下调表达的基因224个，占检出基因总数的11.16%。RT-PCR重复试验表明用Melon cDNA array ver 1.0检测新疆厚皮甜瓜成熟果实基因表达水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花叶病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片检测了17 443个unigenes的表达，发现接种感染后TGR-1551比对照发生了显著的转录差异，与空白对照相比，Tendral有 3 291个unigenes 差异表达，TGR-1551有2 488个unigenes 差异表达，共有677个unigene unigenes受到抑制表达。说明TGR-1551发生了广泛、深刻的转录差异。

在黄瓜上，毛伟华等[24]通过GenBank搜索已发布的生物代谢途径中的关键酶基因序列， 设计特异性引物， 采用RT-PCR法扩增这些酶的相应基因片段，在完成432个基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上研制出国内首张黄瓜cDNA 芯片。该芯片含有9个质控cDNA片段和423个cDNA探针， 涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水-水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺镁胁迫下基因表达谱进行了初步研究， 发现在缺镁胁迫下差异表达的22个基因， 其中10个基因的表达受缺镁处理抑制， 12个基因的表达受缺镁处理诱导。该芯片的研制为进一步研究黄瓜功能基因的高通量时空变化提供了有效的技术支撑。为验证该套cDNA芯片杂交结果的可靠性，毛伟华等[25]研究了黄瓜在CMV 侵染胁迫下的基因表达谱变化，并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR（QRT—PCR）进行检测，共获得67个差异表达显著的基因，其中42个基因下调表达，25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径，许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制，而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达。同时，也发现了一些与CMV 胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究发现，CMV 胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化，PR1-1a 等基因可能在黄瓜防御CMV侵染过程发挥着重要作用。

4 RNAi技术

RNAi（RNA interference）是一种双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技术具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变体，根据表型变异可推测该基因的功能，RNAi已发展成为功能基因组学研究中基因功能鉴定的一种强有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技术沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核细胞翻译起始因子）基因，通过对转基因T2代接种8种甜瓜易侵染的病毒，发现转基因植株对黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）、甜瓜坏死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花叶病毒（MWMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）产生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜对这4种病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因对于甜瓜作物广谱高抗等位基因的发现，将是一个有效的选择途径。程鸿等[27]通过RT-PCR 方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 结果表明，CmMLO2 主要在甜瓜叶片中表达，具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmMLO2表达显著上调，表明CmMLO2 很有可能与白粉病发病有关。构建RNAi表达载体，利用叶盘转化法转化甜瓜，获得了PCR 阳性植株，对白粉病接种鉴定结果表明，转化植株对白粉病具有抗性，证明通过ihpRNAi敲除CmMLO2，可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突变

T-DNA（transferred DNA）是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）内 Ti 质粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并稳定地整合到植物基因组中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给基因贴了一个序列标签。通过分离T-DNA 标签位点的侧翼水稻基因组序列， 可以快捷地找到含有标签的基因， 经过插入标签基因与突变体表型的共分离检测， 从而获得基因的生物学功能。任海英等[28]采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生T-DNA 插入的甜瓜突变体，筛选到一个蔓枯病抗性明显增强的突变体，命名为edr2，该突变体是T-DNA 单拷贝插入甜瓜染色体引起的，edr2 的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路，为挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黄瓜 [31]全基因组测序已完成并对外公布，测序获得的大量生物信息为开展功能基因组学研究奠定了基础，也标志着瓜类作物基因组研究逐步进入到功能基因组研究时代。可以预测，未来将会有更多不同类型的cDNA文库，包括全长cDNA文库被构建，更多的EST序列将被释放，从而为基因芯片的开发提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突变体库的构建工作也将陆续启动或完成，更多的功能基因将被鉴定和分离。功能基因组研究的深入有望鉴定和分离出控制重要农艺性状的全部基因， 揭示基因的时空表达模式，弄清在性状形成中基因与基因的互作，并在此基础上形成对基因调控网络的认识。届时人们就能够从基因结构和基因表达调控两个方面对基因进行修饰，在作物育种实践中实现分子设计育种，从而培育出抗逆性强、品质优良、有益人体健康的西瓜、甜瓜、黄瓜品种，满足人们不断增长的消费需求。

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