诱导性多能干细胞的研究进展和前景展望

张又文　寸湘竹　张可夫等

组织工程是应用工程学及生命科学原理和方法，实现组织保存、修复、功能维持和提高作用的生物学替代物的科学，目的是实现组织器官的功能修复。干细胞不仅可用于再生医学、组织工程，还可应用于生物生长发育机制的研究、药物筛选、基因治疗等领域。因核移植技术以及提取胚胎干细胞面临着材料不易获取、免疫排斥和伦理学争议，其研究发展受限。诱导性多能干细胞（induced Pluripotent stem cells，iPSC）是将影响全能性的外源转录因子基因导入分化的体细胞诱导其重编程成为类似于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESC）的多能干细胞。iPSC制备技术不需要胚胎和卵母细胞，克服了以上限制，应用前景广阔。

1 诱导性多能干细胞的产生

2006年，Takahashi等[1]将24种与全能性相关的转录因子排列组合，利用逆转录病毒载体导入小鼠成纤维细胞，并通过Fbxl5报告基因（细胞多能性标志分子）筛选，确定了4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4可将成纤维细胞重编程为iPSC，其在细胞形态、基因和蛋白表达、生长特性、标志物等方面与小鼠ESC十分相似。这些iPSC能形成畸胎瘤和嵌合体小鼠胚胎，但是不能形成成活嵌合体小鼠并参与到生殖遗传。后来，Okita等[2]改选Nanog进行筛选建立的iPS细胞系相比Fbx15筛选得到的iPSC在基因表达谱和DNA甲基化模式上与ESC更接近，且能够参与成活的嵌合体小鼠生殖系细胞的遗传。2007年，Takahashi等[3]建立了人iPSC，美国Thomson实验室[4]同时报道通过慢病毒转导Oct4，Sox2，Nanog及Lin28四个基因也能将新生儿包皮成纤维母细胞成功重编程为iPSC。随后，多种来源体细胞都被重编程为iPSC。

2 iPS细胞制备技术的优化

2.1转录因子的选择：选择转录的除了由其本身的全能性决定外，还可根据加入的小分子化合物和体细胞内源性转录因子表达水平等多方面综合考虑进行优化。Kim等[5]发现Oct4是必需的，外源Sox2、Klf4 和c-Myc 表达不是iPSC产生的必要条件，其作用是提高诱导效率。增加转录因子使用个数，如：采用六因子（Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4）可显著提高重编程效率[6]，然而转录因子作为外源基因对iPSC的安全也构成了威胁。小分子化合物可替代某些转录因子并提高重编程效率，其机制可能是小分子化合物诱导内源性转录因子的表达，因此有利于安全性的提高。Huangfu等[7]在对组蛋白脱乙酰基酶抑制剂-丙戊酸（VPA）的一系列研究发现，利用VPA可以使只有Oct4、Sox2转录因子的体细胞成功诱导为iPSC。对于小分子化合物的研究加深了对重编程的信号通路和分子机制的研究，使我们能更好地理解体细胞重编程机制。研究已发现有效的小分子化合物还有Vit C、PD0325901、CHIR99021、P53 siRNA和UTF1等，均可提高iPSC产生效率。

2.2外源因子导入方式：逆转录病毒是首次产生iPSC所使用的载体，以逆转录病毒和慢病毒为载体的转染方式会使外源基因和载体序列整合。多病毒整合位点引起的插入突变会干扰正常基因功能，而外源基因的表达会影响细胞分化，导致肿瘤发生。2008年，Stadtfeld等[8]和Okita等[9]分别使用腺病毒和质粒来瞬时转染细胞，成功获得无外源基因整合的iPS细胞，但诱导效率低下。2009年，研究者[10-12]利用Cre/LoxP 重组系统，oriP/EBNA1质粒和piggy-Bac转座子系统将外源基因从iPS细胞中切除，这些方法较为繁琐，安全性也有待验证。直接导入转录因子蛋白或mRNA，被认为是最安全的方法，在重编程因子蛋白上连接细胞穿膜肽组成融合蛋白，可穿透细胞膜进入细胞内部，执行其重编程的功能，蛋白诱导小鼠和人体的iPSC都已实验成功[13]。但是其诱导效率低，且蛋白容易失活。Warren等[14]将4个产生重编程蛋白的mRNA导入细胞以诱导iPS细胞，这种方法效率较高，诱导时间也只需原来的一半。

2.3 体细胞的选择：不同分化阶段的体细胞，在重编程的难易程度、效率、所需因子组合或克隆形成所需时间等方面上是不同的。分化程度低的体细胞，如：神经干细胞、间充质干细胞，其重编程大大易于终末分化的体细胞。同时有研究显示不同来源的iPSC在肿瘤形成上存在很大差异。Aoi等[15]发现成纤维细胞来源的iPSC成瘤性比肝脏细胞和胃表皮细胞来源的iPSC成瘤性要高很多。Sun等[16]发现采用人脂肪干细胞作为供体细胞，效率是皮肤成纤维细胞的20倍，原因可能是脂肪干细胞内源性转录因子的高表达。也有研究[17]采用血细胞来获得iPS细胞，使得其产生方式更为便捷。此外，Yoshida等[18]发现5%低氧浓度的细胞培养环境可有效提高iPSCs的诱导效率。随着对多种体细胞重编程及其机制的研究，将有望找到兼具高效、安全、易于取材等优点的供体细胞。

2.4 iPSC的筛选鉴定：从最开始的Fbx15到选用Nanog或Oct4筛选出与ESC更类似的iPSC，报告基因筛选法都需要对细胞进行遗传学修饰。后来，Maherali等[19]利用形态学标准来筛选鉴定，然而形态学的筛选工作量大，需要研究者丰富的ESC培养经验。现在一般从形态学、分子和功能水平上进行系统地筛选鉴定。在功能上主要是形成畸胎瘤、形成嵌合体、拥有生殖系遗传能力以及产生四倍体能力的鉴定，然而除了畸胎瘤生成，其余鉴定方式都面临伦理问题，不方便应用于人类iPSC。

3 iPSC的应用

构建人类疾病的动物模型，用于细胞替代治疗的研究。2007年，Hanna等[20]利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取尾尖成纤维细胞重编程为iPSC，然后通过同源重组的方法用人野生型βA-珠蛋白基因替代了βS- 珠蛋白基因，接着将修饰过的iPSC定向分化为造血干细胞，移植后治疗动物模型的镰状细胞性贫血。美国学者Wernig等[21]将体外诱导分化的神经前体细胞移植进人小鼠胎脑，形成的神经胶质细胞和神经元细胞具有良好的功能和活性，进一步研究证明移植体外分化的多巴胺能神经元可以明显改善成年帕金森病模型鼠的运动功能。Xu等[22]用iPSC分化而来的内皮前体细胞移植入血友病A的模型小鼠肝脏中，有效改善了出血不止的症状。此外还有多项研究将iPSC在体外定向分化为原始生殖细胞、胰腺细胞、β细胞、心肌细胞等。这都显示了极大的临床应用价值。

此外，人类疾病特异性iPS细胞系的建立，为个性化的治疗提供了可能。2008年，Dimos等[23]将一患有家族性肌萎缩侧索硬化（ALS）的82岁患者的皮肤成纤维细胞成功诱导成iPSC，并分化成带有疾病特征的运动神经元，该模型的建立可以研究ALS的发病机制，提供寻找合适药物靶点，筛选治疗ALS的药物，还可能用于通过遗传修饰得到正常功能的自体神经元进行移植治疗。Park等[24]也建立了多种遗传病患者的特异性的iPS细胞系包括脊髓性肌萎缩（SMA），亨廷顿病，唐氏综合症等。

4 iPS细胞的问题与展望

目前，提高iPS细胞的诱导效率和安全性以使其应用于临床医疗是当前研究的热点，同时iPS细胞还有许多问题需要解答，如：①iPS细胞的体外定向分化不明，许多实验都产生了畸胎瘤或肿瘤；②筛选和鉴定iPS细胞的方法还不够完善，尤其是在人iPS细胞的鉴定上；③需要兼顾重编程效率和安全性，考虑仅利用mRNA、蛋白或小分子化合物来诱导iPS细胞；④需要找出最合适的供体细胞；⑤重编程机制以及iPS细胞与ES细胞在表观遗传修饰和基因表达谱的差异；⑥伦理争议：iPS细胞的全能性使得产生克隆个体成为可能，这会使iPS细胞重新面临伦理学上的争议。虽然iPS细胞现在所面临的问题仍亟待解决，但随着研究的深入，iPS细胞有望与胚胎干细胞一样，被广泛应用于骨、软骨、肌肉、神经、上皮、脂肪、血管内皮组织工程，最终投入到临床上的各类缺损组织修复及美容手术。

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[收稿日期]2013-02-20 [修回日期]2013-04-11

编辑/李阳利