急性下呼吸道感染的病原学诊断

艾效曼 胡云建

【关键词】下呼吸道感染；急诊；病原学

呼吸系统在人体的各个系统中与外环境接触最为频繁，接触面积大。在呼吸过程中，外界环境中的有机或无机粉尘，包括各种微生物、异种蛋白过敏源及有毒、有害气体等皆可吸入呼吸道引起气管-支气管黏膜急性炎症被称为急性下呼吸道感染；也可由鼻咽喉等部位的急性上呼吸道感染迁延而来；呼吸道介入性治疗也是引起医院获得性肺炎的危险因素之一。常见的病原体有病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物。

了解引起呼吸道感染的主要病原体分布有助于初步诊断，此外了解病史、症状、体征以及血清学感染性指标的辅助检查，特别是病原学的检查也非常重要。

急性下呼吸道感染的病原体分布

1 大部分下呼吸道疾病是由细菌以外的病原体引起的，其中以呼吸道病毒最常见，多见于7个病毒科10多类共239个型别的病毒[1]。常见的呼吸道病毒有甲型流感病毒（H1N1、H5N1、H7N9等）、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒和鼻病毒等。

2 非典型病原体肺炎是另一类社区获得性肺炎。2006年全国调查显示，社区获得性肺炎46.9%未能检出细菌及非典型病原体。肺炎支原体是最常见的非典型性病原体，阳性率为20.7%；其次为肺炎链球菌10.3%，流感嗜血杆菌9.2%，肺炎衣原体6.6%，肺炎克雷伯菌6.1%，嗜肺军团菌5.1%等[2]。

3 儿童社区获得性肺炎病原体中非细菌病原体检出率为24.5%，排名前三位的细菌病原体为肺炎链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌[3]。社区获得性肺炎患者常分离出两种或两种以上病原体，

比例在50%左右[2，4]。

4 医院获得性肺炎分离出的病原体中细菌较为常见，鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌占医院获得性肺炎的前三位。国内外报道不动杆菌属对亚胺培南耐药率分别为78.9%（国内数据）和67.3%（国外数据），铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率分别为70.7%（国内数据）和27.2%（国外数据）[5， 6]。

5 中国CHINET细菌耐药监测结果显示，2006年至2010年收集的细菌分别有50.1%，49.2%，49.0%，49.7%，46.9%来自痰液等呼吸道标本，居各类标本首位。

6 分离自肺组织与肺泡灌洗液的细菌中，最常见的细菌依次为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌[7]。其他病原体包括真菌，最为常见的是白色假丝酵母菌和曲霉菌，其次是新型隐球菌和毛霉菌，而芽生菌、孢子丝菌、组织胞浆菌及球孢子菌较少见。此外卡氏肺孢子虫、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌、放线菌及奴卡菌具有重要临床意义。

病原学诊断

病原学检测是诊断感染性疾病的金标准，其次血清特异性抗体检测及其他辅助性指标的检测也有助于对感染性疾病的诊断。

下呼吸道标本的采集

急性下呼吸道感染的标本采集应特别注意时效性，正确的标本采集及恰当的运送条件也是提高阳性病原体检出率的先决条件。由于经过咽喉及口腔排出的痰液标本中混有上呼吸道的共生菌，因而要注意区分病原菌和上呼吸道的正常菌群。下呼吸道基本保持无菌状态。通常上呼吸道标本包括喉部拭子、鼻咽部拭子以及鼻涕等；下呼吸标本包括痰液（自然咳痰、诱导咳痰、负压吸痰、纤支镜下吸痰）、肺泡灌洗液、纤支镜下肺活组织活检、肺穿刺组织活检、开放性肺组织活检等。

采集呼吸道标本的原则为：采集应尽可能在应用抗生素前，正确采集后的标本应立即送检，不能及时送检的应冷藏保存。厌氧菌培养的标本应取气管吸出物，不可用痰液做厌氧菌培养[8]。标本采集质量直接影响到检测结果的准确性。

病毒检测

病毒培养是诊断病毒性肺炎的金标准。此外利用免疫学方法检测抗原或抗体、分子生物学方法进行病毒核酸扩增等方法有效地缩短了病毒检出时间。

用于病毒分离培养的方法有动物培养、鸡胚培养和组织细胞培养，其中根据培养目的病毒种类不同，常用的组织细胞有MDCK细胞，HEP2细胞、VEROslam细胞和LLC-MK2细胞等[9]。

免疫学方法包括血凝试验和血凝抑制试验，可以检测正粘病毒、副粘病毒和流感病毒；免疫荧光或酶联免疫方法可以用来检测抗原，如腺病毒，呼吸道合胞病毒，甲型、乙型流感病毒，1、2、3型副流感病毒等；此外，酶联免疫吸附实验、化学发光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析法既可以检测病毒也可以检测相应抗体。

成人感染呼吸道病毒多为再次感染，因此仅用IgM抗体检测进行病原学诊断应慎重。恢复期血清特异性IgG抗体升高4倍或4倍以上只能提供回顾性诊断，对病毒性肺炎的早期诊疗帮助不大。由于呼吸道病毒种类繁多，利用免疫学方法检测时需要提供特异性抗原或抗体，因此目前能够检测的病原体特别是对新发疾病的诊断仍然有限。普通PCR、多重PCR、多重实时定量PCR及基因芯片等核酸扩增技术与传统检测方法相比，具有快速、高敏感性和高特异性的特点。目前研发的几种多重PCR技术，可以同时检测12～15种病毒，逐渐成为呼吸道病毒检测的标准方法[1，9]。基因芯片技术的高通量特点可同时检测多种呼吸道病毒，对未知新发病毒也可进行筛选。

细菌、真菌学检查

1 涂片检查 下呼吸道标本的涂片检查主要是对标本进行细胞及细菌数量、形态及比例的描述，从细胞学的描述中判断标本是否合格，以及炎性细胞的病理性改变；从细菌的着色、形态及排列描述中初步判断是否有病原菌以及病原菌的数量及其大致类别，有助于指导细菌培养及药敏等后续试验的选择及结果分析。

痰涂片中可以见到的革兰阳性菌有：奴卡氏菌、分枝杆菌、棒状杆菌、肺炎链球菌、链球菌属及葡萄球菌属。可以见到的革兰阴性菌有：肠杆菌科、假单胞菌属、嗜血杆菌属、巴斯德菌属、军团菌、梭菌属、不动杆菌属、奈瑟氏菌属、卡他莫拉菌。同时也可查见酵母菌的菌丝及孢子。

此外应用姬姆萨（Giemsa）染色、六亚甲基四胺银染色（Gomoris methenamine silver nitrate stain， GMS）和亚甲胺蓝染色可见卡氏肺孢子菌，抗酸染色和金胺-O染色可见结核分枝杆菌等。

2 培养及鉴定试验 当怀疑呼吸道有细菌感染存在时，建议先采样进行细菌培养及药物敏感性试验，同时根据病情决定是否经验用药，等到培养及药物敏感性试验结果完成后及时调整用药。通常选用的培养基包括哥伦比亚血培养基、巧克力培养基、中国蓝或麦康凯等选择性培养基。此外，还有许多具有针对性的选择性培养基，有条件的实验室可以同时接种，如真菌显色培养基、耐万古霉素肠球菌选择性培养基、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌选择性培养基等。

当怀疑特殊病原体时应尽量使用针对性的培养基进行培养，如含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE培养基培养军团菌、罗氏鸡蛋培养基培养结核分枝杆菌等。血培养基和巧克力培养基是培养细菌病原体的基本培养基，建议接种。细菌经初次培养、分纯后可用质谱、生化反应等方法进行菌种的鉴定[8，10]。

3 非典型性病原体检测 引起肺炎的非典型性病原体有肺炎支原体、肺炎衣原体、立克次体和军团菌等微生物。多采用分子生物学方法进行检验，或者免疫学方法进行检验血清中特异性抗体，此外尿抗原检测也方便可行。肺炎支原体、肺炎衣原体可以通过分子生物学方法直接检测检出。Silvia等的研究显示，实时定量PCR检测肺炎支原体的灵敏性为93.7%，特异性为98.9%[11]。利用成熟的试剂盒检测急性期和恢复期血清中特异性肺炎支原体、肺炎衣原体或对军团菌IgG抗体含量变化进行诊断仍是常用的免疫学方法。当恢复期IgG抗体阳性或查见IgM抗体及 IgA抗体，且较急性期IgG抗体呈≥4倍升高，定义为双份血清抗体阳性，为急性感染[10，12]。此外，肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌可以通过检测尿液中的抗原进行诊断[13，14]。

4 结核分枝杆菌检测 结核分枝杆菌感染造成的急性下呼吸道感染分为原发性和继发性肺结核。检测技术有痰涂片抗酸染色或金胺-O荧光染色，微生物培养鉴定技术，TB-DNA检测，近年来发展起来的T-SPOT技术或TB血清抗体等检测参考结核菌素实验（PPD）结果进行分析。

金胺-O染色较传统抗酸染色的敏感率高，但痰涂片染色的阳性率仍然低，也不能作为确诊的标志仍需其他方法学进行确认。TB-DNA检测灵敏性、特异性分别为75.9%和98.2%，荧光定量核酸扩增技术的发展和应用也避免了假阳性的发生，已广泛开展。T-SPOT-TB检测方法的灵敏性、特异性分别为62.4%和71.9%，是近年来新发展起来的一项新技术[15]，适用于肺结核以外的结核感染诊断。

5 血清学等辅助性生物标记素的应用 当感染发生，可以参考一些血清学辅助性生物标记素。如白细胞计数（WBC）、淋巴细胞绝对数量或比例、抗链球菌溶血素O检测、快速C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、降钙素原（PCT）、D-二聚体、鲎试验及炎性细胞因子如中性粒细胞脂钙素（HNL）等；血清学检测特异性TB-抗体实验，真菌检测（1-3）-β-D-葡聚糖（G试验）及半乳甘露聚糖试验（GM）等。

6 分子生物学诊断平台 近年来分子生物学的快速发展为各类病原学诊断提供了良好的技术平台，对于急性下呼吸道感染的病原学诊断，时效性格外重要。此外，许多疑难病例的标本取材除常规的痰标本、血样标本及尿样标本外，经CT、B超等引导下穿刺取得的原发病灶病原学标本数量有限，分子生物学方法可满足检测要求。普通PCR、多重PCR、多重实时定量PCR及基因芯片等核酸扩增技术均可用于检测包括病毒、非典型病原体等下呼吸道感染病原。许多细菌的耐药基因也可通过分子生物学进行快速检测如MRSA的检测，大大缩短了临床报告时间，是今后发展的趋势。

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