基于超薄等电聚焦电泳技术的大白菜品种鉴定

摘要：利用超薄等电聚焦电泳技术对8个不同的大白菜品种种子蛋白质进行分析。结果表明，大白菜种子盐溶蛋白具有较高的多态性，在所测试的8个品种中共发现9条蛋白质多态性条带，依这9条蛋白质多态性条带可将8个品种区别开来，与大田种植鉴定结果一致。因此，种子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术可应用于大白菜品种鉴定。

关键词：大白菜；盐溶蛋白；超薄等电聚焦电泳；品种鉴定

中图分类号：S634.103.7；Q503 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）08-0039-03

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis） 适应范围广，栽培面积大，是我国第一大蔬菜作物_[1]。品种改良是实现生产可持续发展的关键因素，随着生产力的发展和人民生活水平的不断提高，大白菜育种日益受到国内外学者的重视。为了在较短时间内培育出高产稳产品系，部分品种采用了共同的亲本或自交系，客观上缩小了品种间的遗传差异性。近年来，大白菜品种日渐增多，同时，在生产上假冒伪劣种子事件时常发生。因此，鉴定品种真实性对大白菜新品种登记和品种知识产权保护等显得极为重要。

目前，大白菜品种鉴定以大田种植鉴定为主_[2]。尽管大田种植鉴定的结果最准确，但其所需时间比较长（通常需要一个生长季节），且要消耗大量的人力和物力，而且很多性状受栽培措施及环境因素的影响_[3]。为此，迫切需要一种准确、快速的大白菜品种鉴定方法。

电泳技术在种子真实性检测中被广泛应用，根据电泳对象的不同可分为同功酶电泳和蛋白质电泳。同功酶电泳技术曾被应用于大白菜品种鉴定_[4～7]。利用同工酶鉴别品种及种子纯度存在的问题是： 同工酶存在时期特异性和器官特异性，多数作物种子需发芽，由于种子发芽速度不同造成个体间差异，容易引起误差，并且同工酶的提取、电泳等多数需要在低温下进行，增加了电泳操作和电泳技术推广的难度。由于同工酶分析存在上述不利因素，在应用中受到限制_[7]。普通聚丙烯酰胺凝胶电泳也应用于品种鉴定，结果表明蛋白质多样性位点的变化不足以区分所有的品种_[5，8]。分子标记作为一种新的基于DNA水平多态性的遗传标记，具有许多优势。分子标记技术越来越多地应用于大白菜的品种鉴定和遗传图谱构建_[7～13]。但分子标记费用高，操作复杂，使它的应用受到了限制。

种子蛋白质超薄等电聚焦电泳 （Ultrathin-layer Isoelectric Focusing， 简称为UTLIEF）是一種简便、快速、准确、经济的蛋白质分离技术，该法在番茄_[14]、水稻_[15]、玉米_[16]、南瓜_[17]等品种鉴定上取得较好结果。目前还未见到利用该技术鉴定大白菜品种的报道。 本研究首次利用UTLIEF技术，对当前生产上栽培面积较大的部分大白菜品种进行鉴定，辨别真伪，为这些品种的管理提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

所用大白菜品种为87-114、神州5号、强者、强势、菊锦、春月黄、冠春、CR黄心秋，均由青岛农业大学农学与植物保护学院程险峰老师提供。

1.2种子蛋白质的提取

取上述不同品种单粒种子放在滤纸上，用研槌逐粒压碎，去壳，置于离心管中，按30∶1（V/W）比例加入蛋白提取液。常温下提取1 h后，10 000 r/min离心10 min。上清液20 μl用于电泳点样。本研究采用3种不同提取液：去离子水、0.01%（W/V）NaCl溶液和30%（V/V）2-氯乙醇。

1.3超薄等电聚焦电泳

按国际种子检验规程_[18]进行。本研究采用4种不同pH范围的两性电解质（3.0～9.5，4.0～7.0，5.0～8.0，6.0～9.0）。

1.4大田种植鉴定

大田种植鉴定在青岛农业大学莱阳试验站进行。在苗期、莲座期、结球期，根据叶片颜色、厚薄、形状；在收获前， 根据叶色、叶球抱合方式、球的形态等特征特性鉴定不同品种。

2结果与分析

2.1超薄等电聚焦电泳鉴定

为了找到合适的蛋白质提取液和合适的pH范围，本研究利用3种不同的提取液结合4种不同pH范围的两性电解质进行试验，结果发现用0.01%（W/V）NaCl溶液和pH范围为5.0～8.0的两性电解质试验时，得到的蛋白质图谱更清晰，多态性条带更多（图1）。其中靠近正极的染色较深，多态性低，而靠近负极的染色浅，多态性高，8个大白菜品种在9个位点上出现了多态性。

不同大白菜品种种子所含的多态性蛋白条带不同（表1），根据所含蛋白质多态性条带差异，很容易将这8个品种区分开。

3讨论与结论

大白菜品种类型多样，为了对商品种子进行品种鉴别、新品种登记测试以及种质资源遗传多样性分析，非常需要一种高效、快速、准确和经济实用的品种鉴别技术。

蛋白质是基因表达的产物，其位点差异代表了植物生物学特性的多态性。种子蛋白质电泳技术不需发芽，省时、省力，试验结果较稳定，不易受外界条件影响，已成为主要农作物种子纯度检测的主要手段。超薄等电聚焦电泳技术分辨率高_[19]，和普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，能检测出更多的总蛋白和多态性蛋白条带_[14～17]。

本研究结果表明，超薄等电聚焦电泳能在不同的大白菜品种种子蛋白质中发现较多的多态性条带，从而将不同的品种区分开来，与大田种植鉴定结果一致。因此，种子蛋白质超薄等电聚焦电泳是一种可靠、简单、快速、经济的大白菜品种鉴定技术。

参考文献：

[1]马京波，姜善涛，崔汉良，等. 早熟大白菜品种金来秋白2号的选育及栽培技术[J].山东农业科学，2012，44（3）：123-124.

[2]王桂娥. 大白菜杂交种子纯度种植鉴定技术[J]. 种子科技，1996，2：39.

[3]林文超，王德森，刘维信. 不同环境条件对紫色大白菜花青素稳定性的影响[J].山东农业科学，2012，44（1）：51-53.

[4]鄭晓鹰，刘岩. 用过氧化物酶及脂酶同功酶鉴定大白菜杂交种纯度[J]. 园艺学报，1994，21（1）： 59- 64.

[5]郑晓鹰，李丽，李秀清. 大白菜品种同功酶及水溶蛋白的遗传多样性分析[J]. 园艺学报，1997，24（3）： 244- 248.

[6]陈启林，陈毓荃，陈静，等. 同工酶PAGE凝胶电泳在大白菜品种鉴定中的应用研究[J]. 西北农业学报，1998，7（2）： 94-97.

[7]Arus P C， Shields R， Citon T J. Application of isozyme electrophoresis for purity testing and cultivar identification of F1 hybrids of Brassica oleracea[J]. Euphytica， 1985，34： 651-657.

[8]张承毅， 吴承来， 张春庆. 蛋白质电泳法鉴定大白菜种子纯度[J]. 山东农业科学，2007，3： 108-110.

[9]宋顺华， 郑晓鹰， 徐家炳， 等.大白菜种质资源的遗传多样性分析[J].华北农学报，2006， 21（3）： 86-90.

[10]周新成，刘立峰，李化银，等. 大白菜EST-SSR标记开发中非SSR标记的鉴别[J]. 山东农业科学，2010，4： 1-3， 7.

[11]张庶，李利斌，王凤德，等. 利用 cDNA-AFLP 分析大白菜、萝卜及其杂交种差异表达基因[J]. 山东农业科学，2011，7：1-4，8.

[12]王燕龙，姜言生，曲志才，等. SSR 分子标记在作物种质资源鉴定中的应用[J].山东农业科学，2012，44（10） ： 11-18.

[13]冯英，张秦英，刘莉， 等. 青麻叶大白菜种质资源遗传多样性的AFLP分析[J].华北农学报，2008，23（3）：56-59.

[14]Van den Berg B M. Inbred testing of tomato （Lycopersicon esculentum L.） F1 varieties by ultrathin-layer isoelectric focusing of seed protein [J]. Electrophoresis，1990，11（10）：824-829.

[15]Zhao T， Yan M， Lu Y P， et al. Genetic purity testing of two-line hybrid rice seeds by ultrathin-layer isoelectric focusing of proteins [J]. Seed Science and Technology，2005，33（2）：45-52.

[16]严敏，王晓峰. 杂交玉米、水稻和辣椒种子品种真实性和纯度的室内快速鉴定[J]. 华南农业大学学报（自然科学版），2003， 2：6-8.

[17]Tu H， Zhang J Q， Wang X F. Variation in seed protein within and among species of Cucurbita by ultrathin-layer isoelectric focusing [J]. Seed Science and Technology，2012，40（3）：113-117.

[18]International Seed Testing Association （ISTA）. International Rules for Seed Testing： Edition 2007 （1st ed.） [M]. Bassersdorf， 2007.

[19]Radola B J. Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films [J]. Electrophoresis，1980，1（1）：43-56.