基于生物素-亲和素放大的SPR传感器检测大肠杆菌研究*

刘儒平，王 程，徐万帮，岳 钊，牛文成，刘国华*

(1.南开大学信息技术科学学院，天津300071;2.广东省食品药品检验所，广州510180)

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全已经成为世界各国关注的焦点之一，各国都采取最先进的技术和方法开展快速检测研究来适应新形势下的需求［1-2］。在卫生质量的评价和控制中，通常采用大肠杆菌作为指示菌，通过对指示菌的检测和控制来了解水体或食品等受污染状况，从而保证卫生安全［3］。水和食品中细菌检测，特别是致病性细菌的检测，对于控制传染病、保护环境卫生和人民群众身体健康有着重要的意义［4-6］。因此，建立特异性强、灵敏度高、快速检测大肠杆菌的新方法成为环境监测和食品卫生领域专家面临的严峻挑战。

目前，对大肠杆菌的检测方法主要有传统的平板计数法，直接免疫荧光(IFA)法以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。平板计数法，操作复杂，耗时长(24 h～48 h)，不适合快速检测［7-9］。直接免疫荧光法(IFA)将荧光素标记在相应的抗体上，与抗原进行反应，具有时间短的优点，但该法无法检测出假阴性样品［10］。酶联免疫吸附试验(ELISA)可对大肠杆菌进行快速准确定量，阴性结果无需其他方法加以证实，而阳性结果则需用培养法确认［11］。

表面等离子体共振(SPR)生物传感技术是一种新兴的检测技术［12-13］。这种传感器是一种光学传感器。SPR是一种物理光学现象，其检测基本原理是当芯片表面的物质或者物质量发生变化时，折射率发生变化，表现为共振角的偏移［14］，一般采用折射率 RIU(Refractive Index Unit)或响应单位 RU(Resonance Units)来表征。SPR生物传感器具有可在线检测、可再生、无需样品前处理等优点，近年来已成为研究热点［15-16］。但其缺点是在芯片表面固定小分子量或低浓度待测物时不能引起大的信号改变，故检测灵敏度较低。

本研究针对大肠杆菌快速、灵敏、特异性检测的需求，以低浓度大肠杆菌ATCC25922检测为切入点，利用一抗和二抗的质量扩增效应和生物素-亲和素的多级放大效应，使用BIACORE 3000 SPR生物传感器系统，开展了大肠杆菌检测的光学生物传感技术研究，实现了大肠杆菌ATCC25922的快速在线检测，该方法在环境监测和食品卫生领域具有广泛的应用前景.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

BIACORE 3000 SPR生物传感器(瑞典BIACORE AB公司)。

单克隆兔抗大肠杆菌ATCC25922血清购于中国兽药监察所，由北京博奥森生物技术有限公司纯化制得兔抗大肠杆菌ATCC25922单克隆抗体;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)购自美国Sigma公司;CM5芯片和盐酸乙醇胺购自瑞士BIACORE AB公司;链霉亲和素、生物素标记的羊抗兔IgG抗体(效价1:500)和磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)购自北京欣经科生物公司;链霉亲和素包被的CdSe/ZnS核壳结构量子点购于武汉珈源公司，采用Tris缓冲液(10 mmol/L Tris，0.1%BSA，0.05%Tween-20，pH 7.4)进行稀释;实验用水均为超纯水(Millipore Milli-Q超纯水系统)，其他无机试剂均为分析纯购于美国Sigma公司。

1.2 SPR生物传感芯片制备

实验过程如图1所示，首先注入80 μL新鲜配制的体积比1∶1的50 mmol/L的NHS和200 mmol/L的EDC混合溶液活化芯片。采用去离子水洗净芯片表面后将70 μL链酶亲和素溶液(浓度为200 μg/mL，用pH 4.8的醋酸缓冲液配制))注入芯片，静置10 min。将亲和素偶联于芯片表面。通入30 μL去离子水清洗芯片。注入100 μL浓度为1 mol/L的封闭剂A(盐酸乙醇胺溶液，pH 8.5)静置10 min，封闭没有和亲和素反应的活化基团。注入80 μL浓度为200 μg/mL生物素标记的羊抗兔IgG抗体PBS溶液(pH=7.4)，静置5 min。利用生物素和链霉亲和素之间的高亲和力将生物素标记的羊抗兔IgG固定在芯片上。芯片洗涤后注入80 μL封闭液B(0.05%Proclin300与10%酪蛋白的Tris-HCl缓冲液)且静置10 min对未反应亲和素位点进行封闭，然后用PBS缓冲液清洗。注入80 μL浓度为250 μg/mL的兔抗大肠杆菌ATCC25922单克隆抗体IgG制备成大肠杆菌ATCC25922特异性免疫传感芯片，对大肠杆菌ATCC25922进行特异性检测。

图1 基于生物素-亲和素放大的SPR传感器检测大肠杆菌ATCC25922示意图

1.3 样品检测与芯片再生

进样检测时，待测液体积为80 μL，整个实验样液流速为10 μL/min，先通入PBS缓冲液，稳定后通入大肠杆菌ATCC25922菌液，测量结果为两者样本响应均值(8个点响应的平均值)的差值。为了提高芯片的使用率，对检测菌液后的芯片用NaOH溶液进行再生。注入 NaOH溶液流速为20 μL/min，进行抗原抗体的解离。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌与两种抗体分步偶联的效果

为了形象地证实大肠杆菌ATCC25922与一抗(兔抗大肠杆菌ATCC25922单克隆抗体)以及二抗(羊抗兔IgG抗体)三者偶联效果，本实验选用武汉珈源公司提供的表面偶联有亲和素的CdSe量子点作为标记物进行观察，将3 μL生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶500稀释)溶液与3 μL浓度为2 nmol/L的表面包被亲和素的CdSe量子点溶液进行反应，37℃孵育箱中孵育10 min，使生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗体)高效的偶联在量子点表面。在其他条件不变的情况下，滴5 μL待测大肠杆菌ATCC25922菌液于洁净载玻片表面，使其尽可能形成单分子薄膜，将该载玻片在空气中自然干燥2 min，采用去离子水清洗3次。然后于菌液所在区域滴加2 μL浓度为250 μg/mL的一抗溶液，用盖玻片推平，37℃下保湿盒中孵育10 min，使得大肠杆菌ATCC25922和一抗高效偶联;然后将上述含有二抗与量子点偶联物的溶液滴加在连有大肠杆菌ATCC25922的一抗表面，并尽可能平铺在载玻片上，37℃孵育箱中孵育5 min使其充分结合，加入200 μL的PBST缓冲液冲洗3次，去掉多余量子点标记二抗，将该载玻片置于荧光显微镜下观察。明场观察如图2(A);在暗场下，打开紫外激发光源进行观察，如图2(B)。量子点在紫外光激发下发出波长为550 nm的绿光，暗场下大肠杆菌约2 μm的椭圆形光点，明场下大肠杆菌与暗场下的光点一一对应，可见大肠杆菌ATCC25922、一抗与二抗三者偶联效果良好，因此通过二抗(抗抗体)的放大效应，捕获大肠杆菌是可行的，且偶联过程未对抗体活性造成较大影响［17］。

图2 大肠杆菌荧光显微镜观测图

2.2 大肠杆菌ATCC25922响应曲线测定

将浓度为1.5×108CFU/mL大肠杆菌ATCC25922菌液用PBS缓冲液梯度稀释为1.5×107CFU/mL、1.5 ×106CFU/mL、1.5 ×105CFU/mL、1.5 ×104CFU/mL、1.5 ×103CFU/mL 和1.5 ×102CFU/mL，利用制备的传感芯片进行测定，6种浓度菌液的测量结果如图3所示。样品检测时，不含大肠杆菌ATCC25922的PBS缓冲液对照组在进样过程中RU值较平稳。以PBS缓冲液为测量基准，传感器响应的平均标准差为21 RU，因此测量大肠杆菌ATCC25922时，大于PBS响应标准差的3倍，即大于63 RU为可信测量值。由图3可知，不同浓度的菌液达到动态平衡后能够明显区分，且浓度越大，RU响应值越大。大肠杆菌ATCC25922菌液浓度为1.5×102CFU/mL响应平均值为83 RU左右，大于63 RU。因此，该传感器的最低检出限为1.5×102CFU/mL。

图3 不同浓度的大肠杆菌ATCC25922溶液的动态响应

2.3 大肠杆菌ATCC25922标准曲线测定

依据检测体系中菌液浓度越大，RU响应值越大的原理，采用研制的传感芯片分别对浓度为1.5 ×102CFU/mL、1.5 × 103CFU/mL、1.5 × 104CFU/mL、1.5 ×105CFU/mL、1.5 ×106CFU/mL 和1.5×107CFU/mL的菌液进行测定。结果表明，大肠杆菌 ATCC25922浓度在 1.5×102CFU/mL～1.5×107CFU/mL范围内与相对响应具有良好的线性关系。其线性方程为ΔRU=23.688Ln(CFU/mL)-66.881，相关系数R为0.981 5。该传感器检测时间小于35 min，具有检测速度快和灵敏度高的特点。本研究灵敏度的提高是由于将生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗体)固定在芯片表面，采用二抗与一抗(兔抗大肠杆菌单克隆抗体IgG)结合，这样使得SPR传感器检测的偶联物质量增大，反应信号增强，提高了检测灵敏度。此外生物素-亲和素体系具有多级放大作用，每个亲和素分子有四个生物素结合位点［18］，可同时以多价形式结合生物素化的抗体。因此，极大地提高了检测灵敏度。

2.4 干扰实验

采用研制的基于生物素-亲和素放大的SPR传感芯片检测大肠杆菌ATCC25922，以肺炎克雷伯菌ATCC13883、金黄葡萄球菌ATCC25923和阴沟肠杆菌ATCC700323分别代替大肠杆菌ATCC25922作为待测物，利用所研制的SPR生物传感芯片进行测定，验证本研究方法对大肠杆菌ATCC25922检测的特异性，结果见表1。干扰菌浓度为104CFU/mL～105CFU/mL时，SPR测量值与空白检测值接近，相对响应RU远低于同量级大肠杆菌ATCC25922浓度的检测值，未发现与金黄葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883和阴沟肠杆菌ATCC700323有交叉反应，说明该方法对大肠杆菌ATCC25922具有特异性。

表1 特异性检测实验结果

2.5 大肠杆菌ATCC25922检测重复性实验

采用所研制的大肠杆菌SPR传感芯片对浓度为1.5×105CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922进行测试，连续检测5次进行重复性实验，实验结果见表2。检测结果的相对标准偏差为4.80%，具有较好的重复性。

表2 细菌检测仪重复性测试结果

2.6 本研究与传统培养计数法相关性分析

采用研制的SPR传感芯片对6个浓度梯度的大肠杆菌ATCC25922样品进行检测与传统培养计数法进行对比测试，大肠杆菌ATCC25922浓度范围:1.5 ×102CFU/mL ～1.5×107CFU/mL，每个样品平行测量3次。首先根据不同浓度的大肠杆菌与相对响应(RU)之间的标准曲线，将所测样品的相对响应换算成浓度。将本方法测试的浓度与平板计数结果测试的浓度(菌落数除以菌液体积)进行对比，两者经相关性分析后的对比结果如图4。结果显示，基于生物素-亲和素放大的SPR传感器快速检测大肠杆菌ATCC25922与传统培养计数法具有良好的相关性，相关系数R=0.986 9(P＜0.05)。

图4 本方法与平板计数法对大肠杆菌ATCC25922样品浓度测试的对比

3 结论

本研究选用Biacore 3000系统及CM5芯片，通过生物素-亲和素放大效应和一抗-二抗的质量扩增效应提高了SPR检测大肠杆菌ATCC25922的灵敏度，成功建立了一种宽动态范围定量检测大肠杆菌ATCC25922的SPR的方法，较现有方法避免了复杂的操作过程。实现了大肠杆菌的低浓度检测，检测下限为1.5×102CFU/mL，检测时间约为35 min。该法与平板计数法对大肠杆菌测试具有良好的相关性。本研究具有操作简便、灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，尤其在食品细菌特异性检测中体现出明显的优越性，该技术在食品安全分析、环境污染检验等方面具有广阔的应用前景。

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