抗粘灵气雾剂中5种成分的提取工艺研究

田力，田晓晔，于鑫琛，于洋，张立群，张霄华，王静

(沈阳医学院临床教研室，辽宁 沈阳 110034)

抗粘灵气雾剂由白芨、黄芪、赤芍、当归等8味中药材组成，用于预防腹腔术后粘连，具有效果确切、方法简便易行，为临床外科领域术中抗粘连有效药物［1—6］。阿魏酸是当归的有效成分之一，有抑制胶原和ADP诱导的血小板聚集作用，对脑血管和白细胞减少症有较好疗效。2010年版药典Ⅰ部规定黄芪甲苷是黄芪的有效成分之一，有降压消炎、镇静镇痛，影响血清和肝脏蛋白质合成，影响血浆CAMP及再生肝DNA合成，促进NK细胞 (自然杀伤细胞)活性及抗肝损害等作用［7］。本文选取阿魏酸、黄芪甲苷为指标成分，通过正交试验设计，考察因素及水平，再进行数据分析，最后获得各因素的最优水平组合，为该方质量控制方法的建立和其深入研究开发提供参考［8－11］。

1 仪器与材料

Agilent1100高效液相色谱仪、Agilent 1100紫外检测器 (美国 Agilent公司);BS110型电子分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司);TG332A型微量分析天平 (上海仪器有限公司);HH-2数显恒温水浴锅 (金坛市新航仪器厂)。阿魏酸、黄芪甲苷对照品 (中国药品生物制品检定所)。

白芨 Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎;黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根;赤芍Paeonia lactiflora Pall.的干燥根;当归Angelica sinensis(Oliv)Diels(A.polymorpha Maxim.var.siuensis Oliv.)的根;灯盏花Erigeron breviscapus(Vant.)Hand. － Mazz.的 干燥全草;大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 提取溶剂的选择

2.1.1 供试品的制备 水提法:按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末适量，精密称定，加10倍量的水，水浴回流1.5 h，过滤，提取液置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴浓缩至稠膏状，用烘箱烘干，即得。

水提－醇沉法:操作方法同上，平行操作4份，自“过滤”起，加入适量乙醇至乙醇浓度分别为40%、55%、75%、85%、95%，4℃冷藏24 h，过滤，减压回收乙醇，浓缩至干，即得。

醇提法:按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末4份，精密称定，分别加10倍量的40%、55%、75%、85%、95%的乙醇，回流提取1.5 h，过滤，提取液置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴浓缩至稠膏状，用烘箱烘干，即得。

2.1.2 浸膏得率的测定 按“2.1.1”项下方法制备供试品，精密称定，计算浸膏得率。结果见表1。由表1可知，浸膏得率大小顺序为水提法＞85%醇提法＞75%醇沉法＞55%醇提法＞75%醇提法＞40%醇提法＞55%醇沉法＞85%醇沉法＞95%醇沉法＞40%醇沉法＞95%醇提法。

表1 不同提取溶剂的测定结果

2.2 指标成分的含量测定

2.2.1 当归中阿魏酸的HPLC测定

2.2.1.1 阿魏酸的提取分离 取当归药材粉末约1 g，精密称定，置50 m l量瓶中，加入甲醇－甲酸 (95∶5)30 ml，超声60 min，放置12 h，加入甲醇－甲酸 (95∶5)至刻度，取上清液经0.5μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液20μl做HPLC分析。

2.2.1.2 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm);柱温:32℃;流动相:5%醋酸－甲醇 (80∶20);流速:1.0 ml/min;检测波长:320 nm;进样量:20μl。

2.2.1.3 色谱系统适用性试验 理论塔板数按阿魏酸色谱峰计算不低于8 000，各色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，阿魏酸色谱峰的拖尾因子为1.02。色谱图见图1。

图1 当归提取物和阿魏酸对照品HPLC色谱图

2.2.1.4 线性 阿魏酸对照品储备液液的配制:精密称取阿魏酸对照品1.00 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

标准曲线的绘制:精密吸取对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml分别置 10 ml量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，做HPLC分析。以阿魏酸的峰面积Y对浓度C作线性回归处理，结果表明阿魏酸对照品在该范围内线性良好。

2.2.1.5 精密度试验 取30.0μg/ml的阿魏酸对照品溶液作HPLC分析，重复进样5次，计算相对标准偏差，RSD为1.13%。

2.2.1.6 重复性 取样品5份，每份约2 g，精密称定，按“2.2.1.1”项下方法提取，按“2.2.1.2”项下方法进行HPLC分析，测定阿魏酸的含量，计算相对标准偏差，RSD为1.7%。

2.2.1.7 回收率试验 取已测阿魏酸含量的当归样品9份，每份约2 g，精密称定，精密加入阿魏酸对照品适量，按“2.2.1.1”项下提取，按“2.2.1.2”项下方法进行HPLC分析，测定阿魏酸的含量。加样回收率结果见表2。

表2 阿魏酸测定回收率 (n=3)

2.2.1.8 样品的测定 将制备好的样品溶液在上述色谱条件下进行测定，结果见表3。

表3 当归中阿魏酸测定结果 (n=3)

2.2.2 黄芪中黄芪甲苷的HPLC测定

2.2.2.1 黄芪甲苷的提取分离 取黄芪样品粉末(40目)约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加入甲醇100 ml，水浴提取3 h。回收甲醇，残渣用20 ml水饱和正丁醇溶解，并转入分液漏斗中。用1%的NaOH溶液洗涤 (5 ml×3次)，再用正丁醇饱和水洗至中性，回收正丁醇，残渣用甲醇溶解，并定容于5 ml量瓶中。用微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液20μl做HPLC分析。

2.2.2.2 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈－水 (30∶70，V/V);流量:1.0 ml/min;检测波长:203 nm;柱温:室温;进样量:20μl。

2.2.2.3 色谱系统适用性试验 理论塔板数按黄芪甲苷峰计算大于10 000，黄芪甲苷峰与相邻峰及内标峰之间分离度大于1.5，拖尾因子为1.01。色谱图见图2。

图2 黄芪提取物 (A)和黄芪甲苷对照品 (B)HPLC色谱图

2.2.2.4 线性 黄芪甲苷对照品储备液的配制:精密称取黄芪甲苷对照品10.04 mg，置于10 m l量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

内标溶液的配制:精密称取卡马西平对照品2.21 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

标准曲线的绘制:分别精密吸取黄芪甲苷对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m l分别置5 ml量瓶中，精密加入内标溶液0.25 ml，用甲醇加至刻度，摇匀，做HPLC分析。以黄芪甲苷与卡马西平峰面积比Y对浓度C作线性回归处理，结果表明黄芪甲苷对照品在该范围内线性良好。

2.2.2.5 精密度试验 取60.0μg/ml的黄芪甲苷对照品溶液作HPLC分析，重复进样5次，计算相对标准差，RSD为0.41%。

2.2.2.6 重复性 取黄芪样品5份，每份约2 g，精密称定，按“2.2.2.1”项下方法提取，按“2.2.2.2”项下方法进行HPLC分析，测定黄芪甲苷的含量，计算相对标准偏差，RSD为1.8%。

2.2.2.7 回收率试验 取已知黄芪甲苷含量的黄芪样品9份，每份约2g，精密称定，精密加入黄芪甲苷对照品溶液适量，按“2.2.2.1”项下提取后，按“2.2.2.2”项下方法进行HPLC分析，测定黄芪甲苷的含量。加样回收率见表4。

2.2.2.8 样品的测定 结果见表5。

表4 黄芪甲苷测定回收率 (n=3)

表5 黄芪中黄芪甲苷测定结果 (n=3)

2.3 提取条件的优化

2.3.1 因素与水平 选用L9(34)正交表安排试验。因素与水平表见表6。

表6 因素与水平表

2.3.2 浸膏得率的测定 按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末适量，精密称定，按L9(34)正交表实验安排，制备抗粘灵提取液。提取液过滤，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，低温水浴浓缩至干，于60℃恒温箱中干燥至恒重，减去蒸发皿的重量，得浸膏重量，计算浸膏得率。结果见表7。

2.3.3 阿魏酸、黄芪甲苷的含量测定 样品溶液的制备:按处方比例取白芨、黄芪、赤芍、当归、灯盏花、大黄药材粉末适量，精密称定，按 L9(34)正交表安排实验，制备抗粘灵提取液。提取液过滤，浓缩至干。干膏用甲醇定容至10 ml，精密量取2 ml样品液于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下进样，外标法计算含量。结果见表8、9。

表7 提取率正交试验结果

表8 阿魏酸正交试验结果

表9 黄芪甲苷正交实验结果

3 讨论

3.1 阿魏酸、黄芪甲苷检测波长与分离条件的选择 经紫外全波长扫描，确认阿魏酸在319.4 nm处有最大吸收，故此方法选用320 nm为测定波长。经紫外全波长扫描，确认黄芪甲苷在203.1 nm处有最大吸收，故此方法选用203 nm为测定波长。

3.2 正交试验结果分析 由表7、8、9可见各因素对浸膏得率的影响为 CBA，最佳水平组合为A2B1C3，即加入10倍量溶剂，提取2次，每次2 h;各因素对阿魏酸含量的影响为CAB，最佳水平组合为A1B3C3，即加入6倍量溶剂，提取2次，每次1.5 h;各因素对黄芪甲苷含量的影响为CAB，最佳水平组合为A1B3C3，即加入6倍量溶剂，提取2次，每次1.5 h。

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