免提取直接扩增技术在现场生物物证中的应用

吴 婷牛青山潘永峰辛 阳

（1 中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035；2 沈阳市公安局刑警支队 辽宁 沈阳 110002）

免提取直接扩增技术在现场生物物证中的应用

吴 婷1牛青山1潘永峰2辛 阳1

（1 中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035；2 沈阳市公安局刑警支队 辽宁 沈阳 110002）

通过采用Golden eye DNA ID System 20A试剂盒，对沈阳市局2013年第二季度实际案例中现场所提取到的生物检材如血滤纸、血棉签、血纱布、烟蒂、吸管、硬质糖果等进行直接扩增检验，以探讨DNA直接扩增检验技术对实际案例中常见现场检材的有效性及可靠性。结果证明直接扩增检验技术能够应用于实际案例中常见现场检材的检测。

直接扩增法 Golden eye DNA ID System 20A 现场生物检材

近年来，DNA鉴定以其特有的技术优势，在公安机关案件侦破及法庭科学证据系统中占有越来越重要的位置。常规法医物证实验室DNA检验过程涉及到DNA提取、定量、PCR扩增及电泳检测等多个操作步骤，其中DNA提取过程就比较繁琐，所以用常规方法完成DNA检测过程需耗费大量的人力、物力、财力及时间。目前，DNA数据库逐渐成为跨时空精确打击犯罪的“刑侦利器”，因此，迫切需要扩大DNA数据库建设的规模。这无疑对传统的DNA检验方式方法及流程提出了新的要求。本实验通过对实际案例中现场提取的检材采用Golden eye DNA ID System 20A进行免DNA提取步骤的直接扩增研究，证明如果检材没有受到土壤等污染可以应用直接扩增法进行DNA检验，并应用于实际工作中。该技术的应用可极大地降低检测成本，加快检测速度，提高实验人员的工作效率。

1 材料与方法

1.1 实验样本

样本为沈阳市局2013年第二季度日常DNA数据库建设所积累。从中随机抽取样本包括血滤纸7例、血棉签27例、血纱布3例、烟蒂6例、吸管1例、硬质糖果1例。

1.2 主要仪器和试剂

Golden eye DNA ID System 20A试剂盒；微量移液器(Gilson)；96孔板；9700型PCR扩增仪(AB公司)；3130xl型遗传分析仪(AB公司)。

1.3 方法

1.3.1 样本分组样本分组见表1。

1.3.2 加样方法

先将预先配好的扩增试剂加入96孔板需要加样本的凹内。剪取不同样本的检材分别置于96孔板凹内。同时，分别剪取A组（浸出液红褐色）和B组（浸出液淡黄色）的血滤纸进行不同浓度浸出液对免提取直接扩增影响的观察。取硬质糖果半份放入洁净提取盒置于冰箱冷冻30分钟，后连盒取出，用20μl移液器吸取20μl预先配好的扩增试剂，在硬质糖果表面反复淬吸，后将淬吸液加入96孔板凹内。在扩增前用洁净10μl枪头将载体较大的棉絮，纱布分别挑出。等位基因标准分型物Ladder 2孔。

表1

1.3.3 扩增条件

使用Golden eye DNA ID System 20A试剂盒进行扩增，本实验扩增体系为20μl：PCR反应液(1×模板)；引物混合物(2×Primer，2×Mix)；去离子水（5×water)。进行28次循环。扩增程序为：95℃，5min，循环0次；94℃，30s，60℃，1min，70℃，1min，28次循环；60℃，30min，15℃，forever。其余操作过程按照试剂和仪器说明书进行。

2 结果

随机抽取沈阳市局2013年第二季度日常DNA数据库建设所积累样本56份，分别为不同载体的血迹、唾液斑。对其进行直接扩增，结果见表2。对于以滤纸为载体的血迹样本，A组浸出液为红褐色，B组浸出液为淡黄色，此两组对比结果见表3。

表2 不同载体上生物检材DNA“直扩”检测结果

表3 浸泡载体后PCR扩增液的颜色对DNA“直扩”的影响

3 讨论

直接扩增的方法在动物、植物和微生物分子生物学中应用较广。该技术快速、准确、稳定，非常适用于DNA数据库建设，还有利于提高基层公安机关应对一些大规模灾难性事故、群体性突发事件中DNA样本检验的能力。

首先，与传统常规方法相比，直接扩增技术具有如下优点：最突出的是省略了DNA提取步骤，仅通过扩增和检测两个步骤即可获得完整的STR分型结果，大大缩短了DNA检验的时间，同时也节约了提取试剂和相关耗材；另外还避免了常规提取、扩增过程中转移样品或试剂可能造成的污染。

其次，通过本次试验研究，直接扩增检验法虽然具有快速、简便的特点，但该方法还有一定的局限性。该方法适用于现场检材量大的DNA快速分析，对于微量和特殊检材，建议不采用该方法进行检验。一般相对洁净的室内现场血迹和唾液斑的提取“直扩”比室外露天泥土灰尘较多的样本成功率更高。例如以棉签为载体的现场血迹没能成功的几个样本均为室外泥沙砖石上转移下来的血迹，为相对不洁净的样本，所含的泥沙等杂质相对过多而抑制直接扩增。另外，本实验中的吸管这一样本就没有检测成功，分析原因可能是由于彩色塑料制品，长时间浸泡在扩增液中进行直接扩增，这其中有可能出现了抑制PCR反应的化学成分。

最后，就本次试验提出几点经验，第一，检材量应与扩增体系相适应，血痕的浸泡液以淡黄或淡红色为宜。本次研究中，如结果所示：扩增28个循环的1-7号滤纸血样中没有取得成功的1-4号样本，均是由于检材量过大，经浸泡后扩增液呈红褐色，虽然样本中DNA的浓度相对增加了，而抑制PCR反应的血红蛋白等物质的含量也同样增加，最终导致试验检测结果不理想；第二，在扩增前用洁净10μl枪头将载体较大的棉絮，纱布分别挑出，能获得更好的检测效果；第三，先加扩增液再逐个加入待检样本，这样能减少邻近样本的污染；第四，电泳前加样应小心操作，切不可吸入检样载体，以免堵塞电泳仪毛细管。参考文献

1.赵兴春，叶健.法庭DNA技术的发展及展望[J].刑事技术，1998，（5）

2.张建，姜成涛，赵兴春，等.DNATyperTM15试剂盒直接扩增检验纸质样本的研究[J].刑事技术，2011，（4）

3.胡兰，陈松，张国臣.国家法庭科学DNA数据库建设势在必行[J].刑事技术，2003，（6）

4.李钧敏，金则新.一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法[J].应用生态学报，2006，17（11）