复方血栓通胶囊中4个有效成分的一测多评定量方法研究*

梁洁萍，陈 思，谢称石，彭 维，苏薇薇 (．中山大学生命科学学院，广东 广州 5075；．广东众生药业股份有限公司，广东 东莞 5335)

中药复方血栓通胶囊具有活血化瘀、益气养阴的功效，用于治疗血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞。现代药理研究[1-3]以及本实验室[4]前期研究表明：三七皂苷类化合物(主要为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1)是复方血栓通胶囊发挥活血化瘀药效的主要物质基础。这种多成分、多功效的特点意味着控制单一成分难以全面控制其质量，需建立简便易行的多成分同步质量控制模式。为此，王智民等[5]提出了“一测多评”法，即利用中药有效成分间的相关关系，只测定一个成分，来实现多个成分的同步测定，近年来已有不少关于这方面的研究[6-8]。复方血栓通胶囊的质量标准收载于《中国药典》2010版一部[9]，“含量测定”项以高效液相色谱外标法测定了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量，外标法虽具有准确度高的优点，但必须有足够量、高纯度的化学对照品，应用中成本较高、方法较复杂。本研究建立的一测多评法，只需人参皂苷Rg1对照品即可同时测定复方血栓通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb14 个有效成分的含量，具有准确、简便、经济实用等优点，现报道如下。

1 仪器与试药

10万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司，BP211D型)；超纯水器(美国密理博Millipore公司，Simplicity)；旋转蒸发仪(德国Laborota公司，4001型)；数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，KQ-250DE型)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪(美国Dionex公司，DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器、Chromeleon6.8数据处理软件)；P680 高效液相色谱仪(美国Dionex公司，ASI-100自动进样器、ATH-585柱温箱、P680四元梯度泵、Ultimate 3000 DAD检测器)。

三七皂苷R1(批号：110745-200617)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201027)、人参皂苷Rb1(批号：110704-200921)、人参皂苷Re(批号：110754-200822)均购自中国药品生物制品检定所；10 批复方血栓通胶囊由广东众生药业股份有限公司提供。

乙腈(美国 Burdick & Jackson) 为色谱纯；甲醇(广东光华化学厂有限公司) 为分析纯、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲酸(瑞士 Fluka Analytical)为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Dionex Acclaim®120 C18(3 μm，150 mm×4.6 mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以w=0.05 %磷酸溶液为流动相B，线性梯度洗脱程序

0～60 min：A(15%→38%)；检测波长为203 nm；柱温25 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。理论板数按三七皂苷R1计不低于10 000。混合对照品及样品色谱图见图1。

图1 复方血栓通的对照品(A)及样品(B)HPLC图1:三七皂苷R1；2:人参皂苷Rg1；3:人参皂苷Re；4:人参皂苷Rb1Fig.1 HPLC of the samples of four mixed reference substances (A)and Compound Xueshuantong capsule(B)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，置同一容量瓶中，加φ=50%甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg10.982 mg、人参皂苷Rb10.918 mg的混合对照品溶液；精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Re对照品适量，加φ=50%甲醇分别制成每1 mL含三七皂苷R10.984 mg、人参皂苷Re 0.904 mg的对照品溶液；精密量取上述人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1混合对照品溶液5 mL，分别精密量取上述三七皂苷R1、人参皂苷Re对照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加φ=50%甲醇至刻度，混匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物适量，混匀，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中加入φ=70%甲醇20 mL，密塞，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，滤过，将滤纸及滤渣置同一锥形瓶中，再加入甲醇20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，滤过，合并两次滤液，减压旋蒸至近干，φ=50%甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积(y)为纵坐标，含量(x)为横坐标，进行回归处理，得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的标准曲线方程，见表1，各标准曲线在线性范围内线性良好。

表1 复方血栓通胶囊中4个成分的标准曲线

2.5 校正因子计算

以人参皂苷Rg1为内标，按一测多评法建立的技术指南[10]中公式(1)，分别计算三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的相对校正因子，结果见表2。

表2 复方血栓通胶囊中3种成分的相对校正因子Table 2 RCFs of three components in Compound Xueshuantong capsule

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD%分别为0.60%、0.4 %、1.00%、1.77%。

2.6.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于配置后0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样分析，记录峰面积，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD%分别为1.05%、0.95%、0.90%、0.30%，表明样品在48 h内稳定。

2.6.3 重复性试验 取复方血栓通胶囊内容物(批次：1110401)约0.5 g共6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb14个成分的含量并计算质量分数的RSD%分别为0.75%、0.64%、0.74%、0.60%。

2.6.4 加样回收率 取复方血栓通胶囊内容物(批号：110401)约0.25 g 共6份，精密称定，分别按各成分在复方中的含量，精密加入与胶囊中含量相当的各对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的加样回收率分别为95.84%、100.71%、97.73%、95.75%，RSD%分别为0.52%、1.44%、3.02%、1.85%。

2.6.5 不同仪器及不同色谱柱考察 精密吸取2.2项下混合对照品溶液5、10、15 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，依据一测多评法建立的技术指南[10]中公式(1)分别计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的校正因子。试验分别考察了2种高效液相色谱仪和3种色谱柱，所得的相对校正因子及其相对标准差见表3，结果表明不同的仪器及不同的色谱柱所得的相对校正因子无显著性差异。

2.7 待测组分色谱峰的定位

采用一测多评法建立的技术指南[10]中保留时间差(ΔtR)的定位方法：测定内标物以及其余待测成分的相对保留时间，计算出内标物与其余待测物的保留时间差，再根据峰形、紫外吸收光谱等信息，就能够正确判断出目标峰的准确峰位置。实验结果见表4，各成分相对保留时间的RSD%≤5%，因此认为利用ΔtR进行峰定位是合理、可行的。

2.8 一测多评法与外标法结果比较研究

分别精密吸取制备好的供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。分别采用外标法和一测多评法计算复方血栓通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，结果见表5，采用统计学t检验，对外标法和一测多评法计算得到的含量进行比较，p>0.05，表明两种方法所测得各成分含量不存在显著性差异，由此说明一测多评法可用于复方血栓通胶囊的多成分质量评价。

表3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子

表4 不同仪器和色谱柱测得相对保留时间

表5 外标法和一测多评法测定复方血栓通中4个成分含量的比较

3 讨 论

本研究构建了复方血栓通中4种有效成分一测多评的方法，经统计学检验，一测多评法与外标法所得结果之间无显著性差异，说明本研究建立的以人参皂苷Rg1为参照对照品的一测多评法具有可行性，只需人参皂苷Rg1对照品，就可进行4个成分同步测定，可替代外标测定法用于复方血栓通胶囊的质量分析。本研究建立的方法，重复性、加样回收率好，与外标法相比具有简便、快速、检测成本低等优点，是适合中药特点多指标质量评价的新方法，为更全面评价复方血栓通的质量提供了科学依据。

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