淫羊藿叶多糖的超声辅助提取工艺研究

刘晓鹏，姜 宁 *，刘志彪

（1.湖北民族学院 科技学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000）

淫羊藿属小蘖科（Berberidaceae）淫羊藿属（Epimedium）植物，主要分布于亚洲、中东、和欧洲的温带和亚热带地区，其中80%分布在中国，一般生长在林下、灌木丛中或阴湿的地方，海拔200m～3700m之间的地区。中国药典2005版、2010版均收载该植物为药用植物[1]，2010版《中国药典》一部中有龟鹿补肾丸、抗骨增生丸、抗骨增生胶囊等多个常用中成药的主要原料药均含淫羊藿[1]。

淫羊藿属植物的化学成分主要为黄酮类、多糖、木脂素类、酚苷类、紫罗酮类、倍半萜类、苯乙醇苷类、生物碱类等；淫羊藿多糖具有激活巨噬细胞T和B淋巴细胞以及网状内皮系统、促进干扰素的合成、增强机体抗菌、抗肿瘤、降低血糖和血脂、抗衰老、抗艾滋病病毒（HIV）、抗疲劳、抗凝血、消除自由基、抗动脉粥样硬化以及恢复机体放化疗后的免疫功能等药理作用，可增强机体免疫力、增强造血功能和调节内分泌等功效[2-3]。传统的中药中，对淫羊藿叶多糖的提取方法是以水煎剂形式的水提法，其提取结果成分不明确，有效成分含量含糊不清。进行淫羊藿叶多糖的提取研究是进一步明确淫羊藿叶多糖的组成、结构及功能的基础。本研究对淫羊藿叶多糖超声提取的方法进行了研究，为进一步对该成分进行药理研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

淫羊藿叶：由恩施隆鑫中药材公司提供，60℃烘干，粉碎，过60目筛；标准葡萄糖、蒽酮、正丁醇、95%vol乙醇为分析纯，浓硫酸、氯仿为化学纯。

1.2 仪器

JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机；紫外分光光度计；水浴锅；离心机等。

1.3 方法

1.3.1 水浴提取淫羊藿叶多糖

采用正交试验水浴提取淫羊藿叶多糖，选取影响水浴提取效果的4个因素：料液比、水浴温度、水浴时间、pH值，设计4因素3水平的正交试验，采用L9（34）正交表，试验数为9（试验设计水平表见表1）。

称取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸缓冲液，按不同因素水平水浴提取，然后离心取上清液，加入3倍体积的乙醇，静置于4℃冰箱2h；离心（转速5000r/min，时间10min），取沉淀，加10mL蒸馏水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀释5倍。取样，用蒽酮比色法测量淫羊藿叶多糖的含量。

表1 水浴提取因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction

1.3.2 超声辅助提取淫羊藿叶多糖

称取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸缓冲液，进行超声波处理，离心取上清液，加3倍体积的乙醇，静置于4℃冰箱中24h；离心（转速5000r/min，时间10min），取沉淀，加10mL蒸馏水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀释5倍。取样用硫酸-蒽酮比色法[4]测量淫羊藿叶多糖的含量。

选取不同的超声波功率：40W、60W、80W、100W、120W进行单因素试验，超声时间30min，料液比1∶80，pH8.0进行单因素试验，多糖的测定按1.3.2的方法进行。试验重复3次。

选取不同的超声时间：10min、20min、30min、40min进行单因素试验，超声功率是60W、料液比1∶80，pH8.0进行单因素试验，多糖的测定按1.3.2的方法进行。试验重复3次。

选取不同的料液比：1∶20、1∶40、1∶60、1∶80进行单因素试验，超声功率60W、时间30min，pH8.0进行单因素试验，多糖的测定按1.3.2的方法进行。试验重复3次。

选取不同的pH值：5.5、6.0、7.0、8.0、8.5进行单因素试验，超声功率60W、时间30min，料液比1∶80进行单因素试验，多糖的测定按1.3.2的方法进行。试验重复3次。

为了综合研究以上4个因素对淫羊藿叶多糖提取效果的影响，设计了4因素3水平的正交试验，试验设计见表2。

表2 超声辅助提取因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

1.3.3 超声辅助提取淫羊藿叶多糖与水浴提取效果的比较

根据正交试验与单因素试验结果，分别选取超声辅助提取的最佳工艺与水浴提取的最佳工艺进行淫羊藿叶多糖的提取，每个试验重复10次以比较二者的提取效果。试验结果用SPSS 16.0 软件包分析。

2 结果与分析

2.1 水浴提取淫羊藿叶多糖的结果与分析

由水浴提取淫羊藿叶多糖正交试验结果得知（表3）：4个影响水浴提取因素的主次顺序为料液比＞水浴温度＞pH值＞水浴时间；水浴提取淫羊藿叶多糖的最佳工艺是A3B1C2D3，即料液比为1∶80、水浴时间60min、水浴温度80℃、浸出液的pH值为8.0。

表3 水浴提取淫羊藿叶多糖正交试验结果Table 3 Result of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

表4 水浴提取淫羊藿叶多糖正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

对水浴提取淫羊藿叶多糖正交试验结果进行方差分析（表4），结果表明，料液比、时间、温度和pH值这4个因素的F值分别为211.721、6.063、32.384和7.970，显著水平均达到p＜0.05，说明这4个因素均能显著影响试验结果。比较4个因素的F值，同样可以得出各因素的主次顺序料液比＞水浴温度＞pH值＞水浴时间，这与上述分析一致。

2.2 超声辅助提取淫羊藿叶多糖的结果与分析

2.2.1 超声功率单因素试验结果与分析

超声功率单因素试验结果（表5）表明，当超声功率为100W时，淫羊藿叶多糖提取率平均达2.25%，为最高值，随着超声功率进一步加大，多糖的提取率不再升高反而下降。对该试验结果进行方差分析（表6），F crit为显著水平达0.05时的F临界值，即F0.05（4，10），由于F＞F crit，可以看出超声辅助有助于淫羊藿叶多糖的提取。

表5 超声功率单因素试验结果Table 5 Result of single factor test on the ultrasonic intensity

表6 超声功率单因素试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic intensity

2.2.2 超声时间单因素试验结果与分析

从超声时间单因素试验结果（表7）可知，当超声时间从10min延长至20min时，超声辅助提取淫羊藿叶多糖的量并未显著增加，当从20min延长至30min时，多糖提取量增加显著，当超声时间进一步延长时，多糖提取的数量又开始下降。对超声单因素试验结果进行方差分析（表8），可以得知F.＞F crit，也就是大于显著水平为0.05时的F临界值，表明超声时间这个因素对淫羊藿叶多糖提取的影响达显著水平。

表7 超声时间单因素试验结果Table 7 Result of single factor test on the ultrasonic time

2.2.3 料液比单因素试验结果与分析

表9的料液比单因素试验结果表明，虽然料液比为1∶80时多糖含量最高，但用LSD法对不同料液比处理间的进行差异显著性分析，发现料液比1∶80与1∶60时无显著差异，所以最佳料液比应为1∶60；方差分析（表10）结果表明，F值大于显著水平为0.05时的F临界值（F crit），说明料液比能显著影响超声辅助提取淫羊藿叶多糖的得率。

表8 超声时间单因素试验结果方差分析Table 8 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic time

表9 料液比单因素试验结果Table 9 Result of single factor test on the material/liquid ratio

表10 料液比单因素试验结果方差分析Table 10 Variance analysis of single factor test on the material/liquid ratio

2.2.4 pH值单因素试验结果与分析

从表11的pH值单因素试验结果可以看出，浸提液在酸性至中性的范围内，超声辅助提取淫羊藿叶多糖的得率逐步增大，当浸出液为微碱性时（pH8.0），多糖的得率为最大值；当浸出液pH值为8.5时，多糖的得率开始下降。对该数据的方差分析（表12）表明，F＞F crit（显著水平为0.05时的F临界值），也就是说pH值这个因素对超声辅助提取淫羊藿叶多糖的得率会产生显著的影响。

表11 pH 值单因素试验结果Table 11 Result of single factor test on the pH value

2.2.5 超声辅助提取淫羊藿叶多糖的正交试验结果分析

超声辅助提取淫羊藿叶多糖的正交试验结果（表13）表明，各因素对超声辅助提取淫羊藿叶多糖影响的主次顺序为A＞D＞B＞C，最优提取工艺是A2B3C1D2，也就是料液比1∶60、超声功率100W、超声时间10min、pH7.0。对此提取工艺进行验证，试验重复10次，淫羊藿叶多糖的得率平均为2.27%。

表12 pH 值单因素试验结果方差分析Table 12 Variance analysis of single factor test on the pH value

表13 超声辅助提取淫羊藿叶多糖正交试验结果Table 13 Result of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

表14为超声辅助提取淫羊藿叶多糖正交试验结果的方差分析，从表14可以看出，料液比、超声功率、超声时间和pH值4个因素对提取结果的影响均达到显著水平（p＜0.05），从它们的F值同样可以得出如下结论：超声辅助提取淫羊藿叶多糖影响因素的主次顺序为料液比＞pH值＞超声功率＞超声时间。

表14 超声辅助提取淫羊藿叶多糖正交试验结果方差分析Table 14 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

2.3 超声辅助提取淫羊藿叶多糖与水浴提取淫羊藿叶多糖效果的比较结果与分析

超声辅助提取淫羊藿叶多糖采用通过单因素试验与正交试验结果分析得出的最佳工艺：料液比1∶60、超声功率100W、超声时间10min、浸提液的pH7.0；水浴提取淫羊藿叶多糖采用通过正交试验结果分析得出的最佳工艺：料液比1∶80、水浴时间60min、水浴温度80℃、浸出液的pH值为8.0。每个试验重复10次，结果为超声辅助提取淫羊藿叶多糖的得率为2.27%，而水浴提取为1.34%，多糖得率提高了68.70%。对试验数据进行t检验，两组数据的差异显著水平达0.01。说明了超声辅助法提取淫羊藿叶多糖明显优于水浴法。

3 讨论

通过超声处理，淫羊藿叶细胞破裂，而且超声波还具有机械振动、乳化扩散、击碎等效应，有利于植物中有效成分的转移、扩散，这就使胞内多糖较水浴浸提的释放量要多得多，加大料液比可以提高多糖浸出的浓度差，使多糖尽快溶入浸出液中[5]。超声功率与超声处理时间的摸索，是为了研究最适合淫羊藿细胞破裂的超声处理条件。

超声辅助提取淫羊藿叶多糖的单因素试验表明：超声功率、超声时间、料液比、浸出液的pH值这4个因素对多糖提取效果均产生显著影响，说明在超声辅助提取淫羊藿叶多糖的工艺摸索中必须对这4个因素都应加以考虑。试验结果表明，超声功率为100W时就能使细胞最大程度的破裂，提高功率对提高得率并无帮助；在单因素试验中超声波处理时间以30min为最优，最佳的pH值为8.0，而在正交试验中超声波处理时间以10min为最优，最佳的pH值为8.0，说明4个因素需要优化组合才能得到最优的淫羊藿叶多糖提取工艺。

通过2种方法的比较试验证明了超声辅助提取淫羊藿叶多糖明显优于水浴提取，多糖的得率提高了68.70%，并且超声处理还具有省时（从60min缩短为10min）、节能等优点。这为工业化大生产提取淫羊藿叶多糖提供了有利的理论依据。

[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]孟 坤，刘冠中.天然药物淫羊藿和巴戟天的免疫调节作用研究进展[J].中国医药学报，2003，18（8）：493-495.

[3]李作洲，徐艳琴，王 瑛，等.淫羊藿属药用植物的研究现状与展望[J].中草药，2005，36（2）：289-295.

[4]常艳旭，李 晋，苏格尔.锁阳不同生育期多糖含量的动态研究[J].内蒙古大学学报：自然科学版，2007，2（38）：237-240.

[5]姜 峰，赵燕禹，姜梅兰，等.功率超声在中药提取过程中的应用[J].化工进展，2007，26（7）：944-948.