5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与原因不明复发性流产关联的Meta分析

刘宇岩，杨博逸，李永芳，卢响响，王 达，孙贵范

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)即自然流产连续发生两次或两次以上，其病因极其复杂，常见的有胚胎染色体异常，子宫畸形或宫腔粘连等解剖异常，黄体功能不足或甲状腺功能低下等内分泌异常，支原体、衣原体、弓形虫、巨细胞病毒等感染因素，以及抗磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体阳性等自身免疫功能紊乱等[1]。然而临床上排除了以上因素后，仍有近1/2的患者病因不明，故称为原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。已有研究发现，RSA的发生率在整个孕龄妇女群体中占1%～2%，而其中约有50%为URSA[2]。造成URSA的主要病因之一即为母体内编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的基因677位点发生突变(677C→T)。该基因位点的突变可直接导致MTHFR的酶活性下降，进而引发机体内同型半胱氨酸水平的升高[3-4]。已有研究证实同型半胱氨酸水平升高可破坏机体凝血与纤溶之间的平衡，使机体处于血栓前状态。由其所致的胎盘动脉栓塞可进一步引发胚胎供血不足、绒毛坏死等不良结果，而这些都是导致自然流产发生的重要原因[5]。截至目前，国内外已进行了大量关于MTHFR C677T基因突变与URSA之间的关联的研究，但其所得到的研究结果之间却存在很大差异。因此，本研究主要通过对1997—2011年发表共22篇文献(9篇关于中国人群的研究，13篇关于除中国外其他12个国家的研究)进行分析，进而对母体MTHFR C677T基因多态性与URSA之间的关联进行一次宏观评价。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所纳入的文献必须为针对MTHFR C677T基因多态性与URSA的患者和健康人群进行的病例对照研究。

1.1.1 纳入标准 (1)研究中所包含的URSA患者与健康个体均来自统一总体，年龄、民族、生活习惯等基本资料均严格匹配，均衡可比；(2)入选文献中必须明确URSA的定义(如注明流产次数和发生的时间)，WHO于2009年明确了RSA的次数，即两次或两次以上的流产[6]，因此本Meta分析所纳入的URSA人群应为在排除其他临床上可查的致流产因素后连续自然流产两次或两次以上的流产个体；(3)入选文献中还需分别列出病例组和对照组中各基因型(即CC、CT、TT)个体的数量，或者可通过给出的各基因型频率计算出相应人数。其中对照组中MTHFR C677T各基因型频率分布应符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

1.1.2 排除标准 (1)文献中未注明样本人群诸如年龄、民族、生活习惯等一般信息者；(2)文献研究中未明确URSA定义者；(3)文献中未列出各基因型频数或频率者。

1.2 文献检索 在检索过程中，我们并未对文献语种加以限制，因此同时利用Pubmed数据库和中国知网(CNKI)以及万方数据库进行检索，前者主要用于检索国外发表的英文文献，而后两者则用于检索中文相关文献。在Pubmed中，我们利用下列关键词对相关文献进行检索：〔mthfr OR methylenetetrahydrofolate reductase(MeSH Terms)〕 AND 〔abortion(MeSH Terms) OR miscarriage(MeSH Terms)OR fetal loss OR pregnancy loss〕。在CNKI和万方数据库中则键入“MTHFR”(或“5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶”)和“流产”搜索相关中文文献。

1.3 文献筛检与数据提取 严格按照上述标准对从各数据库中检索出的相关文献进行了筛选，同时采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)量表对筛选后所有入选文献进行质量评价，包括病例的定义是否充分、病例的代表性、对照的选择、对照的定义及可比性，评价标准满分为9分。从每篇入选文献中提取了文献作者、发表年限、病例组和对照组中分别所包含的研究对象的个数外，对开展研究所在的国家、病例组中个体的流产次数和发生时间以及研究对象的入选标准等信息也进行了提取，因此有助于解释各独立研究结果之间的异质性。

1.4 统计学方法 首先以OR值及其95%CI来分别表示各入选文献中记载的URSA与MTHFR基因突变之间的关联强度，即在URSA病例组与健康对照组之间分别以突变纯合型(TT)个体数与野生型(CC)个体数、突变杂合型(CT)个体数与野生型(CC)个体数、T等位基因携带者(TT+CT)个体数与野生型(CC)个体数、突变纯合型(TT)个体数与C等位基因携带者(CT+CC)个体数以及T等位基因频数与C等位基因频数计算OR值及其95%CI。然后，再以固定效应模型或随机效应模型对上述OR值进行加权合并计算出最后的合并OR值和95%CI。在异质性检验中，我们主要利用Q检验对各独立研究结果进行异质性检验：若P<0.05,则说明差异有统计学意义，此时应改用随机效应模型进行合并。除此之外，我们还可通过I2值对异质性的大小进行评价，I2值的取值范围在0%～100%之间，当I2值为0%代表各独立研究结果间无异质性，各研究结果间的异质性越大，则I2值也随之增大[7]。本次研究中我们还进行了按不同种族和地区分层分析，这样不仅可以降低各独立研究间的异质性，而且还可对中国人群进行重点分析。我们利用Begg等[8]提出的秩相关检验及Egger等[9]提出的线性回归法对本次研究中存在的发表偏倚进行评价。之所以没有单一通过肉眼观察漏斗图的方式对发表偏倚进行评价是因为各独立研究的方法学质量参差不齐，即存在异质性也是导致漏斗图不对称的原因之一，因此也就无法对发表偏倚做出合理评价[10]。本次研究中的所有统计分析均采用Stata 11.0软件实现。

2 结果

2.1 检索结果 首次检索共检出94篇相关文献(中文26篇，英文68篇)。对此94篇相关文献进一步筛选，其中有30篇文献(中文6篇，英文24篇)并未涉及母体MTHFR C677T突变与URSA之间的关联或未进行相关的病例对照研究。在余下的64篇文献中，有英文文献23篇未具体注明病例组和对照组中各基因型人数，予以剔除。此外，还有2篇未注明流产次数(中文1篇，英文1篇)的文献[11-12]和1篇定义流产次数为大于等于一次的英文文献[13]，为尽量缩小本次研究中各独立研究之间的异质性，且严格遵循URSA的定义，决定予以剔除。在进一步剔除了15篇(中文10篇，英文5篇)完全重复的或仅所包含数据重复的文献(对于后者我们选取对研究对象特征描述相对全面，相关数据分析更为细致的文献纳入研究)后，我们得到了23篇符合标准的文献(中文9篇，英文14篇)[14-36]。最后，对该23篇符合标准文献中对照组基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，除文献[36]外，其他所有22篇文献中对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，并最终纳入本次Meta分析中(见表1)。

表1 所有入选文献相关信息

2.2 纳入文献方法学质量评价结果 所纳入的22篇文献文献均符合之前制定的筛选标准,且NOS量表得分均为9分。

2.3 Meta分析结果

2.3.1 整体分析结果 所有22篇文献中共包括URSA患者2 198人，正常对照2 612人。在对各文献中TT与CC、CT与CC、TT+CT与CC以及等位基因T与C之间的OR值进行统计合并，异质性检验发现上述4组数据中各独立研究之间均存在异质性(P<0.05)，因此采用随机效应模型(即DerSimonian and Laird Method)进行合并分析。分析结果显示，基因型为TT和CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者分别高93%和22%，即OR值分别为1.93〔95%CI(1.39,2.68)〕 (见图1)、1.22〔95%CI(0.99,1.50)〕；基因型为TT或CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者高36%，即OR值为1.36〔95%CI(1.10,1.67)〕(见图2)；T等位基因携带者发生URSA的风险较C等位基因携带者高34%，即OR值为1.34〔95%CI(1.14,1.58)〕(见图3)。Begg秩相关检验(P=0.236)及Egger线性回归法(P=0.111)的检验结果均显示本次研究中无发表偏倚存在。

2.3.2 按种族地区分层分析 我们还分别对关于中国人群的9篇文献和针对除中国外其他国家人群13篇文献中的数据进行了统计分析。所有9篇有关中国人群的文献中共包括URSA患者892人，正常对照930人。总TT基因型频率在正常对照组中为12.58%(117/930)，总T等位基因频率为 34.09%(634/1 860)。在对各文献中TT与CC、CT与CC、TT+CT与CC以及等位基因T与C之间的OR值进行统计合并，异质性检验并未发现上述4组数据中的各独立研究之间存在异质性(P值分别为0.924、0.164、0.703、0.948)，因此采用固定效应模型(即Mantel and Haenszel Method)进行合并分析。分析结果显示，基因型为TT和CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者分别高267%和62%，即OR值分别为3.67〔95%CI(2.68，5.03)〕(见图4)、1.62〔95%CI(1.29，2.05)〕；基因型为TT或CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者高105%，即OR值为2.05〔95%CI(1.65，2.55)〕(见图5)；T等位基因携带者发生URSA的风险较C等位基因携带者高89%，即OR值为1.89〔95%CI(1.64，2.18)〕(见图6)。Begg秩相关检验(P=0.917)及Egger线性回归法(P=0.517)的检验结果均显示本次研究中无发表偏倚存在。

注：MTHFR=5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，URSA=原因不明复发性流产

图1 MTHFR基因型TT与URSA发生Meta分析森林图

Figure1 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR

图2 MTHFR基因型TT+CT与URSA发生Meta分析森林图

Figure2 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR

图3 MTHFR基因型T等位基因与URSA发生Meta分析森林图

Figure3 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR

图4 中国人群MTHFR基因型TT与URSA发生Meta分析森林图

Figure4 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR among Chinese people

图5 中国人群MTHFR基因型TT+CT与URSA发生Meta分析森林图

Figure5 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR among Chinese people

图6 中国人群MTHFR基因型T等位基因与URSA发生Meta分析森林图

Figure6 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR among Chinese people

所有13篇来自除中国以外的其他国家的文献中共包括URSA患者1 306人，正常对照1 682人。在对各文献中TT与CC、CT与CC、TT+CT与CC以及等位基因T与C之间的OR值进行统计合并，异质性检验发现上述四组数据中除等位基因T与C之间比较外，其余三组数据中的各独立研究之间均不存在异质性(P值分别为0.081、0.089、0.052、0.023)。然而，合并结果显示各基因型的分布在URSA组和正常对照组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)，即MTHFR C677T突变与URSA发病之间并无关联。Begg秩相关检验(P=0.246)的检验结果显示本次研究中无发表偏倚存在，而Egger线性回归法(P=0.150)的检验结果则显示存在发表偏倚。

3 讨论

MTHFR基因位于染色体1q36.3，目前已发现人类MTHFR有15种点突变类型，其中最重要的是第五个外显子上677位点发生突变，即C677T突变。该位点C等位基因突变为T等位基因，使原编码丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)，进而可影响酶的热敏感性，以及导致酶活性的下降，进而导致了5-甲基四氢叶酸浓度降低，血浆中同型半胱氨酸增高[3-4]。血浆中同型半胱氨酸增高可产生大量的过氧化物和氧自由基，进而抑制血管内皮细胞一氧化氮的合成和释放导致血管功能异常和内皮细胞受损。高同型半胱氨酸水平还可激活凝血因子XII和V，降低抗凝血因子III、IV的活性，抑制和干扰内皮细胞对硫酸肝素的合成，明显减弱其抗凝作用，使血小板功能受损和血栓素A2(TXA2)产生增加，破坏机体凝血与纤溶之间的平衡，使机体处于血栓前状态，加速了动脉粥样硬化和动脉血栓的形成。如果胎盘动脉出现栓塞，则可引发胚胎供血不足、绒毛坏死，进而造成自然流产的发生[37]。

Ren 等[38]曾于2006年对1997—2005年发表的关于MTHFR C677T突变与URSA之间的关联的21篇英文文献和5篇中文文献进行过一次Meta分析，并得出结论MTHFR C677T基因突变仅在中国人群中才与URSA发病相关，而在其他种族和地区人群中与该疾病的发生并无关联。然而，该Meta分析所囊括的中文文献数量较少，也未针对中文文献制定相关检索策略，因此本次研究中所包括的中文文献数量达到9篇之多，旨在重点而且更为系统地针对中国人群中的MTHFR C677T突变与URSA发生之间的关联程度进行评价。

我们在对全部22篇文献进行统计合并后所得结果显示，MTHFR C677T突变与URSA发病之间存在关联，然而在除中国以外的其他国家中并未发现MTHFR C677T基因突变与URSA发病之间存在关联。由此可见，全部22篇文献进行统计合并后得到MTHFR C677T突变与URSA发病之间存在关联的结果主要是由其中的9篇中文文献引起的。相关研究曾发现MTHFR C677T基因型的分布在不同国家，同一国家的不同地区，同一地区的不同种族中的分布有差异，其中亚洲人群中T等位基因频率为2.5%～33%[39]，欧洲人群中T等位基因频率最高(24%～40%)[40]，非洲最低(4.9%～9.1%)[39]。在本次Meta分析所包含的9篇中文文献中，总TT基因型频率在正常对照组中为12.58%，总T等位基因频率为 34.09%，因此从本次研究所得数据可以看出中国健康女性人群中T等位基因携带者的比例明显高于总体亚洲人群的范围，故除了URSA外，还应在中国女性人群中积极预防新生儿神经管畸形，妊娠高血压综合征等其他与MTHFR C677T点突变相关的疾病。

URSA的发病还与体内叶酸水平降低有关[41]，其水平下降直接导致体内甲基供体，即5-甲基四氢叶酸的不足，进而引发同型半胱氨酸水平的升高。尽管近年来中国广泛实施对围孕期妇女增补叶酸的政策，但由于人口基数大、地理位置偏远以及饮食习惯和文化水平差异等因素的影响，很多地区尤其是北方妇女体内叶酸仍然严重缺乏，因此叶酸补给不足也可导致URSA的发生，即成为MTHFR C677T基因多态性与URSA之间关联的一个混杂因素。贺宪民等[42]曾对中国南方和北方女性的MTHFR C677T各基因型的频率进行统计发现，TT基因型在北方和南方女性人群中的频率分别为37.35%和10.44%，差异有统计学意义，结合本次研究结果可推测北方女性对于URSA的易感性更强。本次研究所包含的9篇中文文献中除2篇来自南方城市外，其他7篇均来自北方，可见URSA发病频率在北方明显高于南方，故应加强对北方女性人群实施增补叶酸等相关的预防策略。

尽管在本次研究中我们严格规定了所有检索出的相关文献的入选标准，Begg秩相关检验及Egger线性回归法的检验结果均显示无发表偏倚存在(除对中国以外的13篇文献进行统计合并外)，但与其他所有系统分析一样，本次分析在纳入文献方面实际上仍然存在一定的局限性。在检索相关文献的过程中我们仅通过Pubmed、万方以及CNKI数据库进行搜索，这就不免会遗漏某些未发表文献。此外，入选的文献数量有限，对于RSA的次数和时间的定义不尽相同，而且所使用的实验室设备器材的规格和精确度参差不齐，对研究对象制定的入选标准之间也存在较大差异。有此类混杂因素存在，势必会对最后合并的统计结果造成影响。但尽管如此，本次综合分析所得出的结果具有重要参考价值，尤其对中国资料分析显示的MTHFR C677T基因突变与URSA之间的高度关联应引起关注。

综上所述，本研究得出结论，在中国女性人群中，MTHFR C677T基因多态性与URSA的发生之间存在关联，而在其他国家地区的人群中并未发现该危险因素与URSA之间的关联。但由于所入选文献之间异质性无法完全消除，诸多混杂因素均可对本次研究结果产生影响，其中针对中国人群的相关研究所得出的阴性结果极少被报道最有可能导致本次研究的结果为假阳性。因此，今后在本次研究的基础上应继续进行相关研究，以便进一步探究MTHFR C677T基因突变与URSA之间的关联，进而在该病病因学上有所突破。

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