非小细胞肺癌中缺氧诱导因子1α和环氧化酶2的表达及其与人乳头状瘤病毒感染的相关性研究

周 颖，张 辉，赵 敏，谢永红

缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是氧调节亚基，又是功能亚基，在缺氧条件下HIF-1α具有促进血管形成及影响肿瘤细胞增殖的功能[1]。环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种诱导型酶，与肿瘤细胞的增殖、抗细胞凋亡、肿瘤血管的生成有关[2]。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种DNA病毒，感染人和动物的皮肤或黏膜可引起增殖性损伤。近年来，越来越多的国内外临床和实验室研究检测出肺癌患者携带HPV[3-4]，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染与肺癌的关系，目前说法不一。有关肺癌中HIF-1α和COX-2与HPV感染的关系报道较少。本研究探讨HIF-1α和COX-2在非小细胞肺癌(NSCLC)发生、发展中的作用以及HPV感染与NSCLC的相关性，并初步分析HIF-1α和COX-2与HPV感染的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集秦皇岛市第一医院2012年1—5月NSCLC新鲜癌组织标本60例为NSCLC组，其中男46例，女14例；年龄36～80岁，平均55岁；鳞癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴结转移30例，无淋巴结转移30例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期26例，Ⅲ期6例；吸烟者43例，不吸烟者17例。另选取同期住院的肺良性病变组织20例为肺良性病变组，其中男13例，女7例；年龄28～80岁，平均42岁；肺结核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大疱4例，支气管扩张1例。标本取材后，置-20 ℃保存，甲醛水溶液固定，石蜡包埋。

1.2 HPV聚合酶链式反应(PCR)检测

1.2.1 引物 选用分别用来扩增HPV 16、18型的特异性引物2对，均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。引物序列见表1。

1.2.2 组织DNA的提取 取适量冷存组织，加提取缓冲液制成单细胞悬液后，沸水浴10 min，冷却至室温加蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇反复抽提3次，再经100%冰冷无水乙醇沉淀、70%冰冷无水乙醇洗涤后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)缓冲液溶解，所得DNA在4 ℃保存。

表1 引物序列和产物长度

1.2.3 PCR扩增反应 每25 μl反应体系中包含 10×buffer 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去离子水16.5 μl及DNA模板2 μl。扩增条件：94 ℃预变性5 min，循环特征为94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环，72 ℃延伸8 min。每次实验以不加模板为阴性对照，HPV 16、18型分别用Siha和Hela细胞株DNA作阳性对照。PCR扩增产物用加有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳约40 min，于紫外透射仪上观察结果。

1.3 HIF-1α、COX-2免疫组化检测

1.3.1 试剂与方法 HIF-1α抗体、COX-2抗体及通用型SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，染色步骤严格按试剂盒说明书操作。一抗稀释浓度为1∶100。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

1.3.2 判断标准 HIF-1α阳性表达为细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒，COX-2阳性表达为胞质或胞膜出现棕黄或棕褐色颗粒，显色结果由两位病理医生采用半定量评分系统独立判定。每例均在高倍镜下(×400)随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞百分率，取平均值，用半定量积分法判断结果：0分阴性；1分阳性细胞百分率<25%；2分25%～75%；3分>75%。阳性强度：1分弱表达(浅黄色)；2分中等强度表达(棕黄色)；3分强表达(棕褐色)。两者积分相乘，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(±)，4～6分为中等阳性(+)，7～9分为强阳性(++)。就其结果进行分析，将-、±合并为阴性，+、++合并为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验；相关性采用直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α、COX-2的检测结果及两者的相关性 NSCLC中HIF-1α的阳性表达位于细胞核(见图1)，阳性率为48.3%(29/60)，肺良性病变组未见阳性表达，差异有统计学意义(χ2=15.163,P<0.05)。COX-2的阳性表达位于胞质或胞膜(见图2)，阳性率为58.3%(35/60)，肺良性病变组未见阳性表达，差异有统计学意义(χ2=20.741,P<0.05)。HIF-1α阳性组中COX-2的阳性率为82.8%(24/29)，高于HIF-1α阴性组的35.5%(11/31)，差异有统计学意义(χ2=13.777,P<0.05)。HIF-1α与COX-2的表达量呈正相关(r=0.479，P<0.05)。

2.2 HPV DNA的PCR检测结果及与临床病理特征的关系 HPV DNA检出率NSCLC组为41.7%(25/60)，肺良性病变组为5.0%(1/20)，差异有统计学意义(χ2=9.193,P<0.05，见图3)。HPV 16型12例，占48.0%(12/25)；HPV 18型13例，占52.0%(13/25)，差异无统计学意义(χ2=0.003,P=0.957)。NSCLC组HPV感染与性别、年龄、是否吸烟、组织学分型无关，而与分化程度及有无淋巴结转移相关(P<0.05，见表2)。

2.3 HIF-1α、COX-2的表达与HPV感染的关系 HPV DNA阳性组与阴性组HIF-1α的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；HPV DNA阳性组与阴性组COX-2的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表2 NSCLC患者HPV感染与临床病理特征的关系〔n(%)〕

Table2 Relationship between HPV infection and clinicopathological features of NSCLC

临床病理特征例数HPVDNA阳性 阴性χ2值P值性别0.0110.918 男4619(41.3)27(58.7) 女146(42.9)8(57.1)年龄(岁)0.0230.880 <50156(40.0)9(60.0) ≥504519(42.2)26(57.8)吸烟0.0020.961 是4318(41.9)25(58.1) 否177(41.2)10(58.8)组织学分型0.0820.775 鳞癌4218(42.9)24(57.1) 腺癌187(38.9)11(61.1)分化程度6.8570.009 高分化121(8.3)11(91.7) 中、低分化4824(50.0)24(50.0)淋巴结转移8.2970.004 有3018(60.0)12(40.0) 无307(23.3)23(76.7)

表3 NSCLC患者HPV感染与HIF-1α、COX-2表达的关系

Table3 Relationship between HPV infection and HIF-1α,COX-2 expression in NSCLC

HPVDNA例数HIF-1α阳性 阳性率(%) χ2值 P值COX-2阳性 阳性率(%) χ2值 P值阳性组251352.00.2300.6311560.00.0490.825阴性组351645.72057.1

3 讨论

HIF-1是由α、β亚单位构成的异二聚体，其中HIF-1α受缺氧的调节。在细胞缺氧时，细胞核中HIF-1α显著增加。HIF-1α不仅调节众多的下游基因以维持或促进肿瘤的血管形成和肿瘤的发展，而且可反馈性接受肿瘤生长过程中产生的因子或缺氧环境的调节表达上调，如此形成恶性循环，促进肿瘤生长、浸润和转移[5-6]。本研究中，HIF-1α在NSCLC中的阳性率为48.3%，肺良性病变组未见HIF-1α表达，提示HIF-1α在NSCLC的发生、发展中起重要作用[7]。

M：Marker；1、2：HPV 16阳性、阴性对照；3、4：HPV 16；5、6：HPV 18阳性、阴性对照；7、8：HPV 18

图3 PCR检测HPV 16、18型DNA扩增结果电泳图

Figure3 Electrophoretogram of HPV type 16/18 DNA detected by PCR

COX-2是催化前列腺素合成的限速酶，在正常组织中基本不表达，但在许多病理生理环境下通过生长因子、炎症刺激、癌基因及肿瘤启动子等作用表达上调，并促进肿瘤的发生[8]。COX-2在促进肿瘤新生血管生成、刺激肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡和机体的免疫反应、参与前致癌物的活化、促进肿瘤的浸润和转移方面起着重要作用[9]。HIF-1α和COX-2共同的靶基因为血管内皮生长因子(VEGF)，两者可能通过这一下游路径促进肿瘤的生长和血管的形成。有研究表明COX-2可通过催化其产物前列腺素E2(PGE2)激活HIF-1α活性，通过COX-2/PGE2/HIF-1α/ VEGF途径促进肿瘤血管生成[10]。但也有研究认为，COX-2也是HIF-1α的靶基因之一，受缺氧的诱导活化。两者可能的联系为缺氧诱导HIF-1α的表达，HIF-1α通过与COX-2启动子中的缺氧反应元件结合，激活COX-2的转录，而COX-2可以通过其代谢产物PGE2等反作用于HIF-1α，使HIF-1α活性增加，在核内的积聚增加，翻译转录加速，从而形成一个正反馈网络。本研究发现NSCLC中HIF-1α和COX-2表达呈正相关，提示HIF-1α与COX-2的表达在NSCLC的发生发展中具有协同作用。

HPV感染是宫颈癌的主要病因，然而近年来HPV感染与肺癌的关系已经引起人们的重视[11]。本研究结果显示HPV DNA检出率NSCLC组为41.7%，明显高于肺良性病变组的5.0%，提示HPV感染与NSCLC相关联，且随着肿瘤分化程度的降低而增高，并与淋巴结转移相关。

HIF-1α与HPV感染之间的关系国内外研究较少，其可能的联系有：野生型P53蛋白可通过直接抑制HIF-1α的转录活性和通过促进mdm2介导的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解两种形式抑制HIF-1α活性；而HPV 16、18型E6可以通过降解野生型P53蛋白[12]，从而促进HIF-1α的积聚。但本研究未发现两者有相关性。目前对COX-2与HPV感染之间的关系认识较少，有研究认为，HPV感染致炎症发生，产生大量炎性因子，激活COX-2，炎性细胞表达COX-2，再通过旁分泌机制和信号转导引起黏膜损伤，致使其易受HPV感染[13]。然而本研究发现NSCLC中COX-2表达与HPV感染无协同作用。

综上所述，HIF-1α与 COX-2在NSCLC的发生、发展中具有重要作用。采用药物或应用RNA干扰技术抑制HIF-1α基因的表达以及针对COX-2的靶向治疗将为NSCLC的预防和治疗开辟新的途径。

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