北极狐ESR基因多态性与产仔数关联分析

黄 贺，田亚光，郑 鹏，李和平

(1.东北农业大学 动物科学技术学院，哈尔滨150030; 2.东北林业大学 野生动物资源学院，哈尔滨150040)

利用常规方法对北极狐的繁殖性状进行选择，进展比较缓慢。寻找与北极狐产仔数相关的分子遗传标记，利用分子标记辅助选择与常规选择相结合的方法，能够有效地提高对北极狐繁殖性状的选择进展，从而加快北极狐的育种进展。雌激素受体(estrogen receptor，ESR) 是一种配体激活转录因子家族中的一种核酸受体，具有转录调控蛋白质的功能，影响着雌激素基因在雌性脊椎动物组织的表达与调控。结合了配体的ESR 与特定的DNA 序列，如雌激素应答元件(ESRE)相互作用可以改变雌激素基因的转录，从而影响雌性第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠维持，在胚胎的生长发育中也起重要作用［1］。人的ESR 基因由8 个外显子和7 个内含子组成，长为140 kb，编码595 个氨基酸，cDNA 长2.1 kb，ESRα 蛋白质约为66 KD。1991年，Rothschild［2］首先将ESR 是第一个候选基因对猪的产仔性状进行研究，报道猪ESR 位点的PvuⅡ多态性。Rothschild等［3～6］对位于1 号染色体上的ESR 基因进行RFLP 分析。结果表明，PvuII 酶切位点的一个有利等位基因B 与高窝产仔数有关，BB型母猪第一胎产仔数和产活仔数均高于AA型(P ＜0.01) 。说明ESR 基因与产仔数主效基因紧密连锁。陈克飞等［7］对7 个不同猪种的ESR 基因研究发现，所有猪种的优势基因均为B 等位基因，B 等位基因对总产仔数和活产仔数的影响极显著(P ＜0.01) ，ESR 的BB 基因型个体为高产仔数理想个体。Vrtkova 等［8］认为ESR-PvuⅡ酶切多态性与产仔数呈强相关。毕晓丹等［9］对小尾寒羊ESR 的第一外显子片段进行PCR-SSCP 分析发现多态性，B 等位基因与绵羊高产羔数呈正相关。涂小璐等［10］对皖西白鹅ESR 的部分外显子片段进行克隆分析，发现第一外显子存在一个多态位点，认为B 等位基因是高产蛋量有利基因。ESR 基因在动物繁殖过程中起重要作用，其多态性与北极狐繁殖性状关联是研究的热点。产仔数是养狐业的一个重要的经济性状，提高产仔数可以减少种狐饲养数量，降低生产成本，增加皮张产量，给养狐业带来巨大的经济效益。同时，提高产仔数也是北极狐育种工作的主要目标。运用现代分子生物技术将其在繁殖性能方面的优势挖掘出来，进而通过标记辅助保种、选育等方法将其推广于现代北极狐生产当中，将会给养狐业带来巨大的收益。目前，关于北极狐ESR 基因多态性方面的研究甚少。本试验旨在发现北极狐在繁殖方面的遗传优势，在北极狐群中利用分子标记辅助选择的方法提高其产仔数打下基础，并为北极狐遗传资源的保护和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取哈尔滨松北养狐场的具有完整产仔记录的北极狐233 只，整理2008 ～2011年的母群生产档案，共871 窝产仔记录。

1.2 样品采集

采集带毛囊的针毛作为试验材料，置于含有70% 乙醇的1.5 mL 离心管中，于-20 ℃保存备用

1.3 基因组DNA 的提取

采用酚/氯法提取毛囊组织中的基因组DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取物的质量，经紫外分光光度计定量，并将提取物稀释至50 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.4 引物设计及PCR 扩增

在北极狐ESR 基因exon1 区域各设计一对特异性引物用于PCR 扩增(引物由北京英骏生物技术有限公司合成) 。序列为F: 5'-CGGAGACACGCTGTT GAGC- 3'，R: 5'-ATTACCTGGAGAACGAGCCG-3'。加灭菌双蒸水将引物溶解至浓度为10 μmol·L-1，4 ℃保存。采用PCR 技术扩增ESR 基因的片段，其反应体系为25 μL，其中包括: 10 ×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，DNA 模板(25 ng·μL-1) 2 μL，灭菌双蒸水加至25 μL。PCR 反应条件为:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，28 个循环; 72 ℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物位置及大小如表1 所示。

表1 PCR 产物位置及大小

1.5 SSCP 检测

将5 μL PCR 产物和5 μL 上样缓冲液混合，98 ℃变性10 min，迅速冰浴10 min。样品在14%非变性聚丙烯酰胺凝胶中4 ℃条件下电泳过夜。电泳结束后，进行银染显色和单链构象多态性(SSCP) 分析。

1.6 PCR 产物的克隆和测序

将PCR 产物在15 g·L-1琼脂糖凝胶中电泳检测并回收，在测序仪上双向测序。将测序结果提交BLAST 网站进行比较，确定突变的位置和类型。

1.7 数据统计与分析

计算基因频率、基因型频率、多态信息含量、有效等位基因数、群体杂合度和χ2值，方法参见文献［11，12］。根据影响北极狐繁殖性能的因素，采用SAS 软件，配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较北极狐的总产仔数(TNB) 、产活仔数(NBA) 在各基因型之间的差异。线性混合模型为Yijklm=u +Mi+Gj+Sek+Sil+eijklm，其中Yijklm: 繁殖性状的数值，u: 群体平均值; Mi: 第i 个胎次的固定效应; Gj: 第j 种基因型的固定效应;Sek为季节固定效应; Sil为公狐随机效应;eijklm: 随机残差效应。

2 结果

2.1 SSCP 检测与序列分析

对PCR 扩增产物进行SSCP 检测，发现多态座位，且均出现3 种基因型，分别定义为AA、BB 和AB(图1) 。

对该基因的核苷酸序列进行双向测序分析表明，ESR 基因存在2 种等位基因，分别命名为等位基因A 和B。序列比对表明，ESR 多态的产生是由ESR 基因序列第539 位G→C 突变造成的。

图1 PCR 扩增产物的SSCP 分析

2.2 多态座位基因频率及基因型频率的统计分析

利用PCR-SSCP 方法进行多态性检测，分型后计算多态座位的基因型频率和基因频率(表2) 。由统计结果可知，在北极狐中，ESR 多态座位以A 为优势等位基因，基因频率为0.54。

2.3 ESR 基因群体遗传结构分析

ESR 基因在群体中的遗传纯和度、遗传杂合度、有效等位基因数、多态信息含量结果见表3。由统计结果可知，北极狐群体的多态信息含量小于0.25，纯和度大，说明该群体在这个基因座位的遗传变异小。在此座位上北极狐群体处于Hardy-Weinberg 平衡状态。

2.4 ESR 基因多态性与北极狐产仔性状的关联分析

利用SAS(Version 8.02) 软件的MIXED程序对多态性与产仔数进行关联性分析(表4) 。

对于初产母狐，BB 基因型母狐的TNB和NBA 比AA 基因型母狐分别多2.61 头和1.25 头(P ＜0.05) ; 对于经产母狐，BB 基因型母狐的TNB 和NBA 比AA 基因型母狐分别多2.08 头和1.29 头(P ＜0.05) 。3 种基因型个体TNB 和NBA 的总体趋势为: BB＞AB ＞AA。

表2 ESR 基因两个多态座位的基因型频率和基因频率

表3 ESR 基因多态座位的遗传多态参数

表4 不同基因型对产仔性状的效应

3 讨论

关于ESR 基因多态性，国内外众多学者进行了相关研究，试图寻找ESR 基因变异中有利于提高母畜繁殖潜能的有利基因和优势基因型。国内外一些研究者发现ESR 基因与总产仔数/活产仔数显著相关。Rothschild等［13］对ESR 基因进行RFLP 分析，检测含50%梅山猪血的两个合成系161 头母猪ESR基因的多态性，发现一个特异的3.7 kb 带，命名为等位基因B，并与高窝产仔数有关。BB 基因型母猪初产产仔数和产活仔数比AA基因型母猪高2.3 头(P ＜0.01) ，全部胎次高1.5 头(P ＜0.01) 。Short 等［14］采用PCR-RFLP 技术检测ESR 的基因型，以PIC 公司4 263 头母猪的9 015 窝产仔记录为研究对象，结果表明，BB 基因型母猪比AA 基因型母猪初产产仔数和产活仔数分别多0.91头和0.80 头，经产的均多0.68 头。国内的学者对ESR 基因进行了广泛和深入的研究。大部分研究认为，B 等位基因提高了国外猪种与中国地方猪种的产仔数［15～20］。因此，可以用于育种实践以改良猪的产仔数。而有研究表明，该位点与母猪繁殖性能之间的相关性不高［21，22］; 也有研究表明，A 等位基因在繁殖性能上具有优势效应［23，24］。这些差异可能与猪的品种、饲养水平、样本量及环境不同有关。张淑君等［25］对二花脸猪的研究结果表明，二花脸猪的基因B 的频率极高(0.85) ，大白猪和长白猪的B 基因频率分别为0.47 和0.16，这个结果与Rothschild 等的研究结果相一致，即B 基因频率与产仔数呈正相关。李千军等［26］对ESR 基因多态性与母猪的繁殖性状进行关联分析，结果表明，长白猪的ESR 基因的优势基因是A，初产母猪BB 基因型个体的总产仔数、产活仔数均显著高于AA 基因型个体，经产与初产相反;大白猪的ESR 基因的优势基因是A，初产母猪AA 基因型个体的总产仔数、产活仔数均显著高于BB 基因型个体，在经产母猪中，ESR 基因BB 基因型高于AA 型个体总产仔数和产活仔数高。毕晓丹等［27］对绵羊的ESR基因第1 外显子部分序列进行PCR- SSCP分析，以高繁殖力的小尾寒羊、湖羊、德国肉用美利奴羊和低繁殖力的多赛特羊、萨福克羊为研究对象，在小尾寒羊、湖羊和德国肉用美利奴羊中检测到AA、AB 和BB 三种基因型，在多赛特羊和萨福克羊中检测到AA 和AB 两种基因型，通过纯合子测序发现，BB 基因型和AA 基因型个体在外显子1的第363 位点存在一个C→G 单碱基变异。在小尾寒羊中，AB 基因型个体和BB 基因型个体的产羔数比AA 基因型分别高0.51 只和0.70 只(P ＜0.05) ，因此认为，ESR 基因可能是一个与小尾寒羊多胎性能有关的一个主效基因或与其紧密的遗传连锁。石照应等［28］对贵州小香羊ESR 基因外显子1 的多态性研究表明，贵州小香羊ESR 基因外显子1 的SSCP 呈现一种带型，命名为AA 基因型(野生型) ，不存在多态性。本研究发现北极狐ESR 基因的基因型频率AA ＞AB ＞BB，等位基因频率A ＞B，北极狐的优势等位基因是A 等位基因，BB 是理想基因型，AA 基因型与BB 基因型在第539 bp 处出现1 个G→C的单碱基变异，使BB 基因型个体的产仔数高于AA 基因型个体。本研究结果和毕晓丹等的研究结果较为一致，表现为带有C 碱基的个体产仔数较多，而带有G 碱基的个体产仔数较少，ESR 基因第1 外显子的多态性与产仔性状存在遗传相关，ESR 基因可能是控制北极狐产仔性状的一个主效基因或是与主效基因紧密连锁，能够将ESR 基因作为北极狐高产仔性状的一个分子标记。

母狐年龄是影响多产性的一个重要因素。在本研究中，ESR 基因对母狐初产产仔数的影响高于经产。陈克飞等［29，30］对ESR和FSHβ 的研究中也发现类似的趋势。原因可能是ESR 在胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中对卵泡生长和发育起重要作用。初产母狐年龄较小，生殖器官未达到生殖的最佳时期，而此时参与母畜生殖器官发育的ESR 的mRNA 表达量高，激素产生量多，所以对产仔数的影响效应比较大; 而经产母狐生殖器官发育成熟，处在生殖和生产的最佳阶段，ESR 的分泌逐渐趋于稳定状态，表达量比较低，所以对产仔数的影响效应小，但要彻底弄清该问题，还有待于从蛋白表达方面做进一步研究。

虽然ESR 基因对母狐繁殖性能有显著影响，但结果并不一致。尽管对繁殖性状主基因的研究，有利于进一步认识繁殖性状的遗传机理，加快繁殖性状的改良速度，但影响繁殖性状的因素很多，在利用主基因进行改良时，也应综合考虑其它遗传因素对繁殖性状的影响。所以能否将ESR 基因作为影响北极狐繁殖性能的主基因或候选基因来进行应用，今后的工作还需要通过扩大样本的数量做深入的研究。同时，要记录不同个体的经济性状，为进一步分析基因多态性与北极狐繁殖性状的关系提供更有说服力的依据与参考。

4 结论

在北极狐中，ESR 基因A 等位基因为优势基因; BB 基因型初产母狐和经产母狐的TNB 和NBA 显著高于AA 基因型母狐; 3 种基因型个体TNB 和NBA 的总体趋势为: BB＞AB ＞AA。

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