自身酶解水提取黄芩中黄芩素及汉黄芩素的方法

李晓燕，赵韶华，韩桂茹，安丽娜

(1．河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035;2．河北省食品药品检验院，河北 石家庄 050011;3．承德燕峰药业股份有限公司，河北 石家庄 050091)

黄芩是一种常用中药，为历版中国药典所收载品种，具清热燥湿、泻火解毒、止血，安胎之功效。黄芩中的有效成分主要有黄芩苷、汉黄芩苷及其苷元等黄酮类化合物[1]。而黄芩中的主苷元类，如黄芩素具有非常强的抗菌、抗病毒、抗炎，抗氧化及清除自由基、抗肿瘤及心血管保护等多种生物活性[2]。黄芩苷和黄芩素的大鼠胃、肠吸收动力学研究表明，黄芩素在各部位的吸收程度明显高于黄芩苷，提示黄芩素具有广泛的吸收窗[3]。虽然黄芩素具有上述诸多生物活性及吸收特点，但由于其制备技术的难度所限，很难进行规模化大生产，因此影响了该有效部位的新药开发与临床应用。目前提取黄芩素的方法有自身酶解乙醇提取[4]、纤维素酶解法[5]、酸水解法[6]等，但都不同程度地采用外加试剂或酶的提取方法，长期应用不利于环境保护。本研究中采用黄芩自身的酶，控制酶解条件，用水提取，以物理方法分离黄芩素和汉黄芩素，工艺经济环保，利于产业化。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(Agilent 1100 series);紫外检测器(VWD);电子恒温水浴锅(上海精宏)。黄芩药材由石家庄以岭药业股份有限公司提供;黄芩苷对照品(批号为110715-200514)、黄芩素对照品(批号为 110595-200604)、汉黄芩素对照品(批号为111514-200403)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 黄芩素和汉黄芩素含量测定方法[7]

2．1．1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax-SB C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0．1%磷酸溶液(49∶51);流速:1 mL/min;检测波长:275 nm;柱温:30℃。

2．1．2 溶液制备

精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量，置棕色容量瓶中，分别加甲醇制成每1 mL含黄芩素30 μg、汉黄芩素10 μg的溶液，即得对照品溶液。取酶解后提取物10 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)10 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

方法学考察:经考察，加样回收试验、重复性试验、精密度试验、稳定性试验均符合要求。

2．2 酶解提取工艺

2．2．1 酶解温度考察

取黄芩药材，粗碎成0．5 cm以下的碎块，按药材质量比，加9倍量水，在同一温度下酶解提取2次，每次2 h，酶解温度分别为35，45，55，60，65，70 ℃，滤取悬浮液，煮沸 10 min，冷却，离心，收集沉淀，60℃烘干，即得黄芩苷元总提物。测定总提物中黄芩素、汉黄芩素的含量，结果见表1。酶解温度在45～60℃之间，黄芩素和汉黄芩素的含量较高，70℃时有部分酶被破坏，黄芩素和汉黄芩素的含量有所下降，因此酶解的温度应控制在45～60℃。

表1 不同酶解温度下提取黄芩提取物中黄芩素和汉黄芩素含量

2．2．2 酶解提取正交试验

为筛选最佳的黄芩自身酶提取条件，选取了对提取物收率影响较大的提取次数(因素A)、提取时间(因素B)、加水量(因素C)、空白(因素D)为考察因素，药材酌情碎断成0．5 cm左右的小块，酶解温度设定为50℃，以黄芩素、汉黄芩素的含量及出膏率为考察指标，按如下水平以 L9(34)表进行试验。因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表

取黄芩药材，粗碎成 0．5 cm以下的碎块，称取 500 g，按L9(34)正交表分别酶解提取，滤取悬浮液，煮沸10 min，冷却，离心，收集沉淀，60℃烘干，即得黄芩苷元总提物。测定总提物中黄芩素、汉黄芩素的含量及出膏率，结果见表3。方差分析结果见表4至表6。

表3 正交试验表及结果 L9(34)

表4 黄芩素方差分析结果

表5 汉黄芩素方差分析结果

表6 出膏率方差分析结果

直观分析表明，以黄芩素的含量和出膏率为考察指标，各因素影响大小依次为A＞B＞C，最佳工艺为A3B3C3;以汉黄芩素的含量为指标，各因素影响大小依次为A＞C＞B，最佳工艺为A3B3C3。方差分析表明，提取次数对黄芩素含量及出膏率差异有统计学意义(P＜0．05)，但提取2次和3次时，黄芩素的含量和出膏率均增加幅度较小，其他因素影响均不显著，为省工节能，选择加9倍水，酶解提取2次，时间为每次2 h，因此优选工艺为A2B2C2。

2．2．3 验证试验

按最佳工艺A3B3C3与优选工艺A2B2C2分别进行酶解提取，滤取悬浮液，离心后，烘干，测定出膏率及黄芩素和汉黄芩素含量，每种工艺平行试验3次。结果最佳工艺中黄芩素的平均含量为66．56%，汉黄芩素含量为8．74%，出膏率为8．27%;优选工艺黄芩素的平均含量为67．08%，汉黄芩素含量为8．65%，出膏率为8．06%。最佳工艺和优选工艺各指标相差不大，但优选工艺省工节能，利于产业化。

2．2．4 生产提取工艺确定

取黄芩药材，破碎为0．5 cm以下的碎块。按药材质量比，加9倍量的45～60℃水，在同一温度下酶解提取2次，每次2 h，滤取悬浮液，煮沸10 min，静置，离心，分取沉淀，60℃干燥或取沉淀物加适量水喷雾干燥，得黄芩苷元总提取物。采用高效液相色谱法测定总提取物中黄芩素、汉黄芩素的含量。

3 讨论

目前黄芩苷元的提取依据的都是“相似相溶”的提取原理，即酶解后的黄芩素等苷元类，脱去了结合的糖，变成苷元类的脂溶性成分，不再溶于水，而溶于乙醇、氯仿、甲苯等有机溶剂中，所以都是将酶解后的黄芩药材烘干后，以乙醇为提取溶剂，进行提取。

本方法在提取原理上有了新的改进，突破了多年来“相似相溶”的提取原则，以水为溶剂，采用“非相似相溶”的“固-液-固”提取方法。即固体原料、水溶解提取、酶解悬浮、随即滤取固体总苷元的方法，使提取、酶解能持续不断地进行，黄芩总苷元在不断地被悬浮，分离，不但酶解、提取完全，而且酶解析出的苷元类尽快得到分离，解决了热分解破坏的难题，苷元类产量大、纯度高。

利用悬浮的苷元类为黄白细腻的沉淀，很易通过60目筛网，而黄芩碎块和溶解的黄芩苷不被滤出的粒度和溶解度之差，及时地将析出的苷元类进行分离。本提取方法如同化学反应式中，取走反应产物，可促使化学反应不断向右也就是向最终产物方向进行，直至反应完全一样。巧妙之处就在于利用了苷元类的沉淀与黄芩药材具有显著的粒度之差，而与黄芩苷又具有明显的溶解度之差，才得以顺利实施。

本方法是以水为溶剂，利用黄芩自身所带的酶，无任何外来添加物，绿色、环保、苷元类游离完全、破坏少、纯度高，成本低，是一种适合于大生产的提取工艺。

[1]徐玉田．黄芩的化学成分及现代药理作用研究进展 [J]．光明中医，2010，25(3):544-545．

[2]高 燕，顾振纶，蒋小岗，等．黄芩素药理学研究新进展 [J]．时珍国医国药，2010，21(7):1 765-1 767．

[3]刘太明，蒋学华．黄芩苷和黄芩素大鼠在体胃、肠的吸收动力学研究 [J]．中国中药杂志，2006，31(12):999-1 001．

[4]刘志刚，颜仁梁，徐昌瑞，等．黄芩自生酶催化水解总黄酮苷的工艺研究 [J]．解放军药学学报，2008，24(2):130-132．

[5]王宏志，喻春皓，高 钧，等．酶法提取黄芩中黄芩素和汉黄芩素[J]．中药材，2007，30(7):851-854．

[6]李玉萍，刘建涛，熊向源，等．黄芩素的制备及抗糖尿病研究概况[J]．安徽农业科学，2009，37(32):15 648-15 651，15 654．

[7]李晓燕，赵韶华，韩桂茹．自身酶解法测定黄芩药材中黄芩素和汉黄芩素的含量[J]．中国药业，2012，21(9):10-11．