太空诱变对紫花苜蓿耐盐性及离体再生的影响

郭慧琴　李晶　任卫波　陈立波　刘雅学　赵海霞

摘要：为了揭示太空诱变对苜蓿耐盐能力的影响，以搭载种子、未搭载苜蓿种子及耐盐品种中苜1号为材料，研究了盐胁迫下苜蓿种子发芽及其再生能力的变化。结果表明，太空诱变后，苜蓿耐盐性与未搭载和中苜1号相比显著增强，250 mmol/L NaCl胁迫下种子发芽率比未搭载增加25.7%，发芽时间缩短，子叶畸变率低。同时，搭载后的种子组培再生能力显著增强，表现为愈伤诱导、胚状体诱导、不定芽形成及根分化的数量和质量显著高于未搭载对照及中苜1号。通过盐胁迫条件下筛选，最终获得3株耐盐变异材料。

关键词：紫花苜蓿；诱变；空间搭载；耐盐；离体再生

中图分类号：S 541.035 文献标识码：A 文章编号：10095500（2013）01002504

太空诱变是利用近地空间环境中重粒子辐射＼[1-3＼]、微重力＼[4-6＼]、弱磁场＼[4＼]等因素，对搭载植物材料进行诱变，从而通过筛选获得有益变异材料＼[7＼]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是重要的多年生豆科牧草，因具有高蛋白、富含维生素、适口性好等优点，被广泛种植。开展苜蓿种子太空诱变效应研究，对于筛选优异变异材料，加快新品种选育具有重要意义。

已有的研究表明，紫花苜蓿种子经过太空诱变后，染色体、细胞核畸变率显著提高＼[8＼]，诱变效应显著。进一步分析表明，搭载后苜蓿的株高、初级分枝数、定植当年的单株生物量、叶数等重要的经济性状均可发生显著变化，通过筛选，有望获得优质、高产的变异材料＼[9-11＼]。此外还发现，经过太空诱变后，苜蓿叶片厚度、栅栏组织厚度均大于对照，这可能影响其抗逆性＼[11＼]。然而，有关太空诱变对苜蓿耐盐能力影响的研究相对较少。通过研究250 mmol/L NaCl胁迫下苜蓿种子发芽能力及组培再生能力的变化，揭示太空诱变对苜蓿芽期耐盐能力的影响，为获得耐盐变异材料提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试苜蓿品系种子由中国农业科学院草原所提供，随机分为2份，1份作为地面未搭载对照（ck），另1份用于太空搭载。搭载种子封入布袋，搭载于我国发射“实践八号”育种卫星（2006.9.92006.9.24）进行太空诱变处理。对照品种中苜1号（Medicago sativa cv.Zhongmu No.1）种子由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫浓度优化 供试种子消毒（75%酒精浸1 min+30% H2O2浸泡30 min）后，用无菌水冲洗干净，接种于无菌苗培养基（MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖）进行发芽试验。盐浓度设置5个水平：0、50、100、150和250 mmol/L。每个水平设4个重复，每个重复50粒种子。培养条件，25 ℃，光照强度2 500 lx，光暗周期16 h/8 h。1周后开始统计正常种苗数、不正常种苗数、死种子数，并计算种子发芽率。

发芽率=正常种苗数/供试种子数×100

子叶畸变率=畸变子叶种苗数/供试种苗数×100

1.2.2 耐盐植株再生 在250 mmol/L NaCl胁迫下，选取生长健康的无菌苗，切取子叶、下胚轴进行愈伤组织诱导，愈伤诱导培养基SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl。获得愈伤组织经胚状体诱导，培养基为＼[SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+水解酪蛋白10 g/L+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl＼]、分化（MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl）和生根（1/2 MS+7.5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖）培养，最终获得再生植株。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaCl胁迫对紫花苜蓿发芽的影响

当NaCl浓度0～150 mmol/L时，随着浓度的增加，苜蓿种子发芽率略微降低，差异不显著（图1）。当浓度为250 mmol/L时，苜蓿种子发芽率比正常水平（0 mmol/L NaCl）降低26%，差异极显著（P<0.01）（图1）。此外，在250 mmol/L NaCl胁迫下，苜蓿种子发芽时间从7～10 d延长至31～33 d，发芽时间延长了近3倍，多数种苗出现生长缓慢、子叶发白、畸变率高。因此，选定250 mmol/L NaCl作为筛选耐盐突变体的盐浓度。

2.2 太空诱变对紫花苜蓿耐盐发芽能力的影响

无盐胁迫，中苜1号、地面对照及搭载种子发芽率达到98%以上，三者间无显著差异，此外种苗生长健康，无明显畸变。在250 mmol/L NaCl胁迫下，中苜1号和地面未搭载对照种子发芽率显著降低，发芽天数由原来的7 d增加到20 d。与未搭载对照和中苜1号相比，太空诱变种子发芽率分别比未搭载对照和中苜1号高25%和27%，差异极显著（P<0.01）（表1）。此外，搭载后苜蓿种苗生长健康，多数种苗无失绿、畸变等现象。

2.3 太空诱变对紫花苜蓿NaCl胁迫下组织培养再生能力的影响

在250 mmol/L NaCl胁迫下，与未搭载对照相比，太空诱变组培再生能力显著增强，主要表现为子叶愈伤诱导率、子叶胚状体诱导数、胚轴愈伤诱导率、胚轴胚状体数显著提高（P<0.05）（图2）。中苜1号与未搭载对照间无显著差异。

在高盐胁迫下，地面未搭载对照外植体会在培养过程中出现变白而凋亡，多数无法形成正常愈伤；即使少量可以形成愈伤，但愈伤组织颜色较浅，结构松散，不利于不定芽的形成及根分化（图3）。

与对照相比，搭载后种子组织再生能力显著增强，可形成高质量的愈伤组织，主要表现为愈伤组织颜色深绿，结构紧凑，且其表面容易形成较大的不定芽，通过分化，可获得完整植株。最终通过多次筛选，获得3株耐盐变异植株。

3 讨论与结论

研究发现，经太空诱变后，苜蓿种子耐盐发芽能力显著提高，表现为种子发芽速度快，发芽率显著提高。这与已有的研究结果基本一致。杜志钊等＼[12＼]研究发现，经过太空搭载后，在0.5% NaCl胁迫下，飞行组大麦种子的发芽率比对照高34%；在1.0% NaCl胁迫下，飞行组种子发芽率比对照高40%，表明太空诱变可显著提高大麦种子芽期耐盐能力。陆瑞菊等＼[13＼]研究发现，经过空间搭载后，大麦种子盐胁迫发芽能力显著提高，表现为250 mmol/L NaCl胁迫下，大部分飞行材料主根长度、发根数、发芽率等显著提高。

注：1～3分别为未搭载对照下胚轴诱导愈伤组织、不定芽和再生苗；4～6分别为太空诱变材料诱导愈伤组织、不定芽和再生苗

太空诱变与组织培养相结合是筛选抗逆胁迫变异品系的有效途径之一＼[17＼]。苜蓿的组培再生能力受基因型、外植体类型、激素配比等因素影响＼[14-16＼]。研究发现，太空诱变对苜蓿盐胁迫下组培再生能力有显著影响，表现为愈伤组织、不定芽形成速度与质量显著提高。这与搭载后苜蓿耐盐能力增强有关。这与已有的研究结果基本一致。亚麻种子经过太空诱变后，其后代抗NaCl、PEG能力增强，通过组培得到抗1.2 % NaCl的变异系。当NaCl浓度在0.9%时，变异系相对生长量（胁迫条件下实际生长量/无胁迫条件下生长量）保持70%，而此时对照只要10%。对照系在盐浓度大于1.2%时生长完全被抑制，变异系明显表现出对盐抗性＼[18＼]。

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