消毒愈肌膏对大鼠糖尿病足溃疡组织BMP-9、TGF-β1 表达的影响

郑德松 李旗 田福玲 刘国荣 陈金铭 马树祥 崔建美 王洪彬 李雪青

糖尿病足是糖尿病常见的、严重的临床并发症之一，局部溃疡既是糖尿病足的一种临床主要表现形式，也是糖尿病足恢复的一大障碍。本研究应用消毒愈肌膏对大鼠糖尿病足溃疡进行干预，观察基因骨形态发生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9，BMP-9)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达的变化，为糖尿病足的临床防治提供理论依据和实验基础，对糖尿病足的发展、维持和预后形成新认识，并在此基础上开展相应的防治措施。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及药品

消毒愈肌膏由黄连20 g、黄柏30 g、白芷25 g、甘草60 g、当归10 g、血竭20 g、轻粉20 g、虫白蜡10 g、紫草10 g、麻油500 g 组成(参照《中国药典》2005 年版一部，由河北联合大学附属医院制剂室制备)。TGF-β 参照文献方法，从人血小板中提纯鉴定［1］。BMP 参照文献方法，从牛皮质骨中提纯鉴 定［2］。焦 碳 酸 二 乙 酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，TRIzol 试剂购于Invitrogen 公司，RNeasy Mini kitRNA 试剂盒购于QIAGEN 公司，miRCURYTMArray Power 标记试剂盒、PhalanxTM 的热收缩杂交袋及miRCU-RYTM(v.11.0)芯片购于Exiqon 公司，Prime-ScriptTMRT Reagent kit 逆转录试剂盒及SYBR(Premix ExTaqTM)实时定量PCR试剂盒购于TaKaRa 公司，目的基因及内参引物均由奥科生物技术公司合成，GenePix pro V6.0 和AxonGenePix 4000B 芯片扫描分析仪购于美国Axon 公司，NanoDrop(ND-1000)购于摩根生物科技公司。

1.2 实验动物

清洁级Wistar 大鼠80 只，雌雄各半(河北联合大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXKll-00-0010)，按随机数字表法分为中药组、BMP-9 对照组、TGF-β1 对照组、模型组，每组20 只。中药组:在患处外敷消毒愈肌膏无菌油纱条外敷，无菌纱布包扎，每2 天换药1 次，观察30 天。BMP-9 对照组:腹腔注射外源性BMP-9，5 μg/kg，每两天注射一次，观察30 天。TGF-β1 对照组:腹腔注射外源性TGFβ1，5 μg/kg，每两天注射一次，观察30 天。模型组:在患处应用无菌盐水，无菌纱布包扎，每2 天换药1次，观察30 天。

1.3 模型制备

［3］，选用Wistar 大鼠饲养28 天后，禁食6 小时后，以pH=4.2，0.1 mmol/L 的枸橼酸钠缓冲液在4℃条件下，链脲佐菌素STZ 配成1%溶液，以55.0 mg/kg 的剂量在大鼠空腹时左下腹注射，注射后第5 天起连续3 天监测空腹血糖，空腹血糖在12.0 mmol/ml 以上者(80 只)入选继续造模。选择大鼠的足背皮肤，用薄铁片固定，持续按压直径5 mm 的铁片，每次30 分钟，每天2 次。按压后用50%冰醋酸涂抹创面，连续刺激1 周后形成缺损性皮肤溃疡大鼠模型。

1.4 检测指标

溃疡区组织BMP-9，TGF-β1 含量。

1.5 基因表达谱检测

取大鼠足背部溃疡区组织标本，置液氮中保存。标本总RNA 抽提及质量检测:每100 mg 组织标本，加入1 ml 的Trizol 提取总RNA，应用kitRNA纯化总RNA。使用NanoDrop 测定RNA 在分光光度计260 nm、280 nm 和230 nm 的吸收值，计算浓度并评估纯度。另外，进行变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察并拍摄，以检测RNA 纯度及完整性。RNA 的标记及芯片杂交:采用miRCU-RYTMArray Power 标记酶将Hy3TM 荧光基团标记RNA，得到用于与芯片杂交的荧光探针。在标准条件下使用PhalanxTM 的热收缩杂交袋将标记好的探针和miRCU-RYTM 芯片进行杂交。采用AxonGenePix 扫描芯片的荧光强度，使用GenePix pro 进行BMP-9，TGF-β1 含量数据分析及统计处理。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，BMP-9 和TGF-β1 作为计量资料，采用t 检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

BMP-9 对照组和中药组中BMP-9 基因表达明显增加，与模型组相比有显著差异(t=12.740，P=0.000;t=3.947，P=0.009)，BMP-9 对照组与中药组BMP-9 基因表达相比有显著差异(t=3479，P=0.03);TGF-β1 对照组和中药组中TGF-β1 基因表达明显增高，与模型组相比有极显著差异(t=7.024，P=0.000;t=8.193，P=0.009)，TGF-β1 对照组与中药组相比，TGF-β1 基因表达无明显差异(t=0.240，P=0.813)，BMP-9 和TGF-β1 表达变化呈显著正相关(r=0.951，P≤0.000)，见表1。

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足溃疡组织表达，n=20)

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足溃疡组织表达，n=20)

注:与BMP-9、TGF-β1 对照组和中药组比较aP ＜0.01;与中药组比较bP ＜0.05，cP ＞0.05

组 别 BMP-9(μg ∕L) TGF-β1(μg ∕L)模型组 83.268±12.36a 698.32±75.12a BMP-9 对照组 206.33±45.32b —TGF-β1 对照组 — 1326.45±401.39c中药组153.02±33.68 1283.99±312.94

3 讨论

本研究中消毒愈肌膏是以《外科正宗》生肌玉红膏为主方，加上黄连，黄柏，其功用具有解毒消肿、生肌止痛。诸多研究报道表明TGF-β1 在糖尿病创面愈合过程中的具有积极作用，在组织修复病理过程中具有调节血管和成纤维细胞增生、间质蛋白合成等作用，同时可以中和抗体的应用大大减少了纤维细胞介质对皮肤成纤维细胞增殖、迁移和胶原收缩的影响［4-6］。另一方面，TGF-β1 可抑制NO/cGMP 信号以确保其对皮肤成纤维细胞胶原生产的刺激作用，在一定程度上不仅利于创面愈合，而且对于组织疤痕的形成有一定的抑制作用［7-9］。本研究经过对各组实验数据的分析发现，TGF-β1 对照组和中药组TGF-β1 基因表达明显增高，与模型组相比有显著差异(P ＜0.01)，证明消毒愈肌膏能显著调控TGF-β1 表达水平，间接刺激组织细胞的分裂增殖，以利于创伤修复。

近几年研究发现，BMP-9 可诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化，骨骼肌源性干细胞存在于骨骼肌中，它是一种具有分化为肌细胞等多种细胞系能力的细胞［10-12］。BMP-9 对照组和中药组BMP-9 基因明显增加，与模型组相比有极显著差异(P ＜0.01)，BMP-9 对照组与中药组BMP-9 基因相比有显著差异(P ＜0.05)证明消毒愈肌膏能显著调控BMP-9表达水平，间接刺激肌组织细胞的分裂增殖，以利于创伤修复。

在消毒愈肌膏干预下，基因表达发生积极的变化，对糖尿病足溃疡组织愈合提供生物基础。但消毒愈肌膏成分复杂、途径繁多、靶点多样的特点，基因的变化受到多种因素的影响，这些基因是始动因素还是下游产物，就基因谱表达本身尚难定论，需要在后续的研究中进一步的验证和探讨。

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