水甘油通道蛋白7在肥胖易感和肥胖抵抗大鼠脂肪组织的表达*

王晓珂 ，赵健亚 ，刘天娥 ，张 璇 ，吴俊霞 ，王 春 ，陈 刚

（南通大学公共卫生学院1环境卫生学教研室；2营养与食品卫生学教研室，江苏 226001）

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是介导水分子穿透细胞膜的蛋白通道的总称，共有13种（AQP 0～12）。水通道蛋白又可以根据它们的渗透特征分为水通道蛋白和水甘油通道蛋白。AQP3、AQP7、AQP9和AQP10属于水甘油通道蛋白亚组，因为他们既能介导细胞对水的运输，又能介导对甘油等其他一些小分子溶质的运输。AQP7是目前发现的脂肪细胞内唯一的水甘油通道蛋白[1]。AQP7的基因最早是从人的脂肪细胞中克隆成功，后来在小鼠和大鼠中也获得了其同源序列，所以AQP7又称为脂肪水通道。有研究发现，AQP7基因敲除小鼠发生了成年期肥胖[2]。3T3-L1细胞的研究结果也显示，AQP7的过表达可以促进PKB的磷酸化，改善脂肪细胞的胰岛素抵抗[3]。以上结果提示AQP7可能参与了肥胖的发生，但是目前仍缺乏相关的报道。高脂饮食是肥胖发生的重要危险因素，但高脂饮食条件下，并不是所有的个体都发生肥胖，其中有一部分个体表现出了肥胖抵抗[4]。因此本研究拟建立高脂膳食诱导的肥胖和肥胖抵抗大鼠，通过检测肥胖和肥胖抵抗大鼠脂肪组织中AQP7的表达，探讨脂肪组织中AQP7的表达与高脂膳食诱导的肥胖发生的关系，进一步阐明肥胖发生的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物和试剂:鼠龄为6周的SPF级雄性SD大鼠34只［西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2008-0016］。2种饲料（上海斯莱克实验动物有限公司），普通饲料总热能3.52kcal/g，其中碳水化合物60.5%，蛋白质25.7%，脂肪13.8%。高脂饲料总热能4.67 kcal/g，其碳水化合物37%，蛋白质18%，脂肪45%。血糖、TC、TG、HDL试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；胰岛素放免试剂盒（北方生物技术研究所）；Trizol和引物序列（美国Invitrogen公司）；RT-PCR试剂（日本Takara公司）；荧光实时定量PCR仪LC-480（罗氏公司）。全自动生化分析仪（AU5831）（贝克曼公司）。（2）动物的饲养和分组：大鼠适应性饲养1周，按体重分为2组，实验组（24只）喂以高脂饲料；对照组（10只）喂以普通饲料。第8周时，高脂膳食诱导组的大鼠体重趋于稳定，参照对照组大鼠的平均体重及标准差，将高脂饲料组大鼠分为饮食诱导肥胖（OP）大鼠（体重大于对照组平均体重加1.96倍标准差）和饮食诱导肥胖抵抗（OR）大鼠（体重小于对照组平均体重加1倍标准差），体重位于二者之间的大鼠不用于本实验研究。各组大鼠均单笼饲养，自由摄食自由饮水。动物房温度（20±2）℃，相对湿度(50±10)%，明暗周期 12∶12。

1.2 方法 （1）口服葡萄糖耐量实验（OGTT）：实验结束前1周，计算每只大鼠所需20%葡萄糖溶液的体积。大鼠过夜禁食16h，以2g/kg体重剂量行葡萄糖溶液灌喂，采取灌胃前及灌胃后30分钟、60分钟、90分钟、120分钟的尾静脉血，利用罗氏血糖监测仪测量血糖水平。(2)组织样品的收集与相关生化指标测定：实验期间每天观测大鼠一般情况，每周测定大鼠的体重。实验结束后大鼠麻醉采血后处死，快速分离出肾周和睾周脂肪组织并准确称重。部分脂肪组织固定后进行苏木精-伊红HE染色，观察脂肪细胞结构和形态的变化。部分液氮冻存后转移至-80℃冰箱保存，以备RNA的抽提。脂体比%=（肾周脂肪+睾周脂肪）/体重×100。（3）实时荧光定量PCR测定肾周脂肪组织AQP7 mRNA表达：按Trizol说明书从大鼠脂肪组织提取总RNA，核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，在20μL的反应体系中将3.0 μg的RNA逆转录得到cDNA。自基因库查得目的基因核酸序列，设计 PCR 引物。β-actin（200bp），上游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG 3’，下游引物：5’-CTCCGGAGTCCATCACAATG-3’；AQP7（200bp），上游引物：5’-GGAGTTCCTGAGTACCTATG-3’, 下游引物：5’-GGCCTAGTGCACAGTTAGTG-3’。利用LC-480 PCR仪进行实时荧光定量，结果分析应用 2-△△ct法[5]。

1.3 统计学处理 实验所得数据录入Microsoft Excel 2010软件，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量数据以表示，多组间的样本均数比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验期间大鼠的体重变化 8周末高脂膳食组有8只大鼠被判定为OP组大鼠，8只大鼠被判定为OR组大鼠。各组大鼠的体重在实验开始时差异无统计学意义，随着喂养时间的推移大鼠体重逐渐增加，第3周至实验结束，OP组的体重显著大于OR组和对照组，OR组与对照组的体重相比差异无统计学意义（图1A）。OP组大鼠的体脂含量也显著高于OR组和对照组大鼠，OR组与对照组相比也显著增加（图1B）。

2.2 鼠血清主要生化指标 各组大鼠的血糖含量（GLU）差异无统计学意义；OP组大鼠的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、胰岛素（Insulin）含量和稳态胰岛素评价指数 (HOMA-IR)显著高于对照组和OR组，OR组的TC和TG与对照组相比差异无统计学意义，而Insulin含量和HOMA-IR与C组相比则显著增加。见表1。

表1 大鼠血清主要生化指标（）

表1 大鼠血清主要生化指标（）

与 C 组相比，*P＜0.05；与 OR 组相比，△P＜0.05

生化指标 OP OR C TC（mmoL/L） 1.43±0.14*△ 1.15±0.10 1.17±0.15 TG（mmoL/L） 0.78±0.13*△ 0.62±0.04 0.51±0.0.08 GLU（mmoL/L） 6.84±0.66 6.83±0.67 6.50±0.53 Insulin（μIU/mL） 66.09±8.06*△ 48.03±8.70* 29.57±6.94 HOMA-IR 19.63±3.08*△ 14.74±9.51* 8.08±0.81

2.3 大鼠脂肪细胞的HE染色结果 对照组细胞分布均匀且细胞完整，OR组细胞体积明显增大，但是细胞形状完整，OP组细胞体积显著增加，并出现细胞破裂的现象，细胞内脂质过度蓄积。图2显示的是放大200倍的3组大鼠肾周脂肪组织的染色情况。

图2 脂肪组织的病理切片（HE，200×）

2.4 大鼠口服葡萄糖耐量实验（OGTT）结果 实验开始时，各组大鼠的空腹血糖比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠予葡萄糖2g/kg灌胃后，各组大鼠的血糖出现了不同程度的增高，60分钟后逐渐恢复。OP组大鼠30分钟至120分钟的血糖含量显著大于OR组和对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，OR组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；OP组大鼠曲线下面积与OR组和对照组相比也显著增加，而OR组和对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 大鼠口服葡萄糖耐量结果

2.5 各组大鼠肾周脂肪组织APQ7 mRNA表达OP组大鼠脂肪组织APQ7 mRNA表达与OR组和对照组相比显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），而OR组与对照组大鼠相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图 4）。

图4 各组大鼠脂肪组织APQ7 mRNA的表达

3 讨 论

肥胖作为影响人类健康和寿命的10大威胁之一，目前已经引起全球各国的广泛关注。但人们对肥胖的认知还只是冰山一角，还不能对肥胖进行清楚的指导和有效的防治。肥胖发生的根本原因是能量摄入大于能量消耗，脂肪组织作为能量蓄积的重要器官，在肥胖研究中越来越受到重视。最近研究发现，AQP7作为脂肪组织介导甘油释放的重要通道，在保持机体能量平衡和葡萄糖稳态方面发挥重要作用。还与机体脂肪细胞、脂肪组织的形态、生理变化及肥胖的形成密切相关[6]。但AQP7在肥胖发生中的作用还没有被完全认识清楚。

本次研究结果显示，肥胖易感大鼠的体重、体脂含量和脂肪细胞体积与肥胖抵抗和对照组大鼠相比显著增加，说明肥胖易感和肥胖抵抗大鼠模型建立成功。对脂肪组织AQP7的mRNA表达进行分析发现，肥胖易感大鼠AQP7的表达显著高于肥胖抵抗和对照组大鼠。袁振芳等[7]对肥胖女性与体重正常女性内脏和皮下脂肪组织水通道蛋白7表达水平进行比较也发现，肥胖者皮下及内脏脂肪的AQP7 mRNA含量较体重正常者增高。Catalan等[8]在检测到肥胖者内脏脂肪细胞AQP7 mRNA水平，与正常组相比有增高趋势。Kishida等[9]也报道肥胖小鼠附睾脂肪的AQP7 mRNA表达是增高的，以上与我们的实验结果一致，进一步说明AQP7的表达与肥胖密切相关。

但也有研究显示，敲除AQP7小鼠发生成年型肥胖，而增加AQP7的表达则可以促进脂肪细胞甘油的释放并改善胰岛素抵抗[2]，与本文的实验结果不一致。这可能与以下原因有关：第一，王宏丽等[10]报道肥胖个体脂肪细胞油滴的基础脂肪分解率是有所增加的，而随着脂肪分解率增加，脂肪组织就会释放更多的甘油和FFA，AQP7随之代偿性增多。本次研究结果也发现，肥胖易感组的TC和TG水平与对照组和肥胖抵抗组相比较有显著增加。段玉敏等[11]对2型糖尿病动物模型OLETF大鼠肾周脂肪组织AQP7的表达研究发现，AQP7 mRNA与蛋白表达在糖尿病初期18周时增高，随糖尿病加重和肥胖程度加重，到28周却出现下降趋势。以上研究提示肥胖易感组AQP7的表达增加可能与代偿有关。第二，早期研究发现胰岛素可以抑制AQP7的表达[9]，本文结果显示，肥胖易感组的胰岛素含量显著高于肥胖抵抗组和对照组，但是HOMA-IR和OGTT的结果提示肥胖组大鼠存在着严重的胰岛素抵抗。由此推测，肥胖组的AQP7的表达增加可能与肥胖易感大鼠胰岛素调节受损相关，具体的分子机制有待于进一步的探讨。

综上所述，AQP7的基因表达在肥胖易感和肥胖抵抗大鼠中存在着显著差异，提示AQP7与肥胖的发生密切相关。在后续的研究中，我们将在肥胖易感和肥胖抵抗大鼠模型建立的过程中，动态观察脂肪组织AQP7的表达变化。进一步探讨AQP7与肥胖发生的关系，这对寻找新的肥胖防治靶点有着重要的意义。

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