毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展

夏姗 ，武福军 ，赵洪亮 ，薛冲 ，刘志敏

1.安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230039；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西 长治 046000

20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22 g/L[4]，破伤风片段C产量高达12 g/L[5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8 g/L[6]等，而最低的报道只有1 mg/L，其间相差可达10 000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation）也成为一个关键技术环节。

1 毕赤酵母工程菌的选择和改良

1.1 工程菌的选择

目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow，muts或mut-），它们只能利用弱的aox2基因启动合成醇氧化酶（AOX），而aox1基因完整的酵母则生长正常（mut+）。目前这2种表型的毕赤酵母菌株在高密度大规模表达时均有使用，主要根据具体的外源蛋白来选择，如根据表达产物的分子大小、降解产物的多少、蛋白折叠程度等性质选择工程菌的表型。如考虑到后续产品的制备，一般选用无缺陷的mut+菌株，对外源蛋白适用性好，便于发酵控制[7]；如果是胞内表达，应尽量用muts菌株，这样得到的蛋白产物中AOX较少而目的蛋白量相对较多（占毕赤酵母总分泌蛋白量的30%～90%，使下游纯化更易进行[8]）。

1.2 对重组转化子的筛选

为了获得高产量的表达菌株，就需要对大量转化子进行筛选，这就要求人们在考察菌体对表达产物表达水平的同时，也要考虑到该表达系统对表达产物的影响。如果工程菌表达系统中表达产物容易降解或易受培养基成分的影响，需要考虑表达产物是选择分泌表达还是细胞内表达。

2 培养基的设计和优化

目前在毕赤酵母表达外源蛋白的培养过程中，主要使用不同大小的生物反应器，采取补料-分批发酵（fed-batch）工艺，包括基础培养相、流加补料相（进一步提高菌体密度）和诱导表达相的三相发酵，而高密度发酵培养主要是通过基础培养相来实现菌种的生长、增殖，再通过流加补料相进一步使菌体大量增殖与累积，从而达到高密度菌体。

2.1 基础培养基的选择

补料-分批培养中的培养基的组分直接影响细胞的生长和外源基因的表达。在毕赤酵母高密度培养时，培养基主要包括BMGY/BMMY、BMG/BMM和BSM，也有部分使用MGY/MMY培养基。基础盐培养基（BSM）在低pH值条件下处于溶解状态，但在高pH值条件下易产生盐沉淀，所以在生产时一般使用低浓度的盐或优化后的培养基。BMGY/BMMY、BMG/BMM培养基中包含磷酸盐缓冲液，可以维持培养基中的pH值保持相对恒定，适用于对pH值敏感的表达产物的表达，但由于培养基组分和多步操作，在生产中容易引起污染。由于表达产物的特殊性和多样性，在分批培养过程中需要对培养基进行筛选和优化。另外，为了保护目的产物的活性和不被降解，须在培养基中添加蛋白酶抑制剂或EDTA等保护剂，以降低蛋白酶对表达产物的降解[9]。

2.2 补料培养基的补加方式

目前毕赤酵母发酵过程中的补料培养基主要成分为葡萄糖和甘油，含诱导型启动子的菌株一般在甲醇和甘油或甲醇和葡萄糖的培养基中生长[10]；而组成型启动子［如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的启动子］则可以不需要甲醇的诱导在含葡萄糖的培养基中正常生长[11]。葡萄糖作为碳源性价比较高，有利于工业化生产；甘油作为毕赤酵母的碳源，效果优于葡萄糖，但其浓度过高和过低均会影响菌体的生长。为了实现菌体高密度发酵的同时又有利于大规模生产，许多研究者对补料方式做了深入细致的研究，主要包括间歇式补料发酵、恒速流加补料发酵、指数流加发酵及在不同时期综合考虑的流加方式[12]。间歇式补料发酵是最常见的流加发酵方式，即每隔一段时间补料一次；恒速流加补料发酵，以恒定流速补加培养基，直到诱导表达开始；指数流加发酵是随微生物生长同步补加的方式，在一定范围内菌体量随时间以指数函数增加，所以流加补料也随时间以指数函数增加，这种流加需要对菌体的生长速率有准确的把握，其生长速率的大小也会影响菌体的生长。Cunha等在研究scFv受体片段的发酵过程中，发现在诱导阶段细胞浓度和甲醇的摄取率是对表达量影响最大的因素[13]。在规模化大生产过程中，补料方式的选择要综合考虑生产成本和菌体增殖，同时要考虑到补料对目的表达产物的影响。目前有研究采用时间分段，各段采用不同的补加方式，既有利于菌体的生长又有利于培养基的完全利用。

3 发酵过程控制

目前，对毕赤酵母的高密度发酵培养的过程控制策略呈多样化，比如对影响菌体生长的各个因素的控制、对细胞生长速率的控制、反馈控制和对培养基成分浓度的控制等，但各控制之间关联因素多，无法形成一个合理的模型控制，需要进一步探索。

3.1 发酵过程参数的控制

3.1.1 溶氧的控制 对于毕赤酵母而言，发酵培养中的溶解氧是影响生长表达的关键因素。高密度发酵需要消耗大量氧气，尤其在菌体快速生长期间，供氧往往成为菌体大量生长的限制因素，保证氧气的供给成为高密度发酵的重要因素。培养基中溶解氧的提高主要受通气量、搅拌速度、罐压的直接影响，

以及温度、补料速度等的间接影响，因此溶解氧可以反映出菌体生长情况。为了提高溶解氧的浓度，生产上开始采用纯氧和空气按一定比例混合通气的方式来提高供氧能力，尽力解决由于缺氧带来的限制。但是，也有研究表明氧浓度太高会抑制菌体的生长和繁殖[14]。

3.1.2 温度的控制 温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果。温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质（溶解氧量、基质的分解吸收速率等）及生物合成方向等都有影响。温度升高，有利于生长代谢和蛋白表达，但温度过高反而会使菌体过早衰老，发酵周期缩短，蛋白表达量和活性降低，表达产物的产量受到影响。因此，必须选择合适的温度，而且在不同的阶段应选择不同的温度，采用变温发酵。菌体生长最适温度为28～30℃，这有利于菌体大量而快速生长；诱导表达的最适温度应适当降低，降低温度也可以缓减溶氧的压力，这样有利于蛋白的表达，同时低温有利于蛋白的正确折叠，提高蛋白稳定性。研究发现，诱导期间降低温度，在提高目的产物累积的同时，也可以减少菌体的凋亡和保护目的表达产物不被降解[15]。

3.1.3 pH值的控制 pH值是发酵体系中的重要化学参数，它不仅与菌体的生长有关，而且和目的表达产物的合成也有关系。目前在毕赤酵母工程菌发酵生产过程中，一般采用变调pH值的办法来控制菌种的生长和目的表达产物的表达。毕赤酵母在pH3～7的条件下均可以生长，范围比较宽泛。但考虑到菌体细胞膜的性质，以及工程菌的生长过程会产生各种代谢产物，而它们会对工程菌后期诱导表达相产生重要影响，因此，pH值在发酵生产过程中一般控制在4～6，这样既可以使菌体正常生长，又可以缓解代谢副产物对菌体的抑制性影响[16]。在高密度发酵表达过程中，为了保证目的表达产物的生物活性，防止被蛋白酶降解，必须选择合适的pH值；另一方面，最适pH值的选择应尽量偏离目的表达产物的等电点。由于在诱导表达期间，菌体的代谢较快，pH值的变化也会变快，所以要维持恒定的pH值就必须使用酸碱调节剂来调节，在工业生产中一般选用氨水，同时又可以补充菌体生长和表达目的产物所必需的氮源。

3.2 反馈控制

3.2.1 根据发酵体系内菌体比生长率控制 依据细胞数量与光密度的关联性，营养物质消耗与活细胞密度积分之间化学计量比例关系及菌体的比生长速率（μ）可以反映菌体生物量和菌体的生长状态。在菌体快速生长阶段，可以根据菌体的比生长速率来调节补料的速度和方式，从而使菌体在短时间内达到快速增殖，这样既节省了发酵时间，同时又达到了快速积累高密度菌体的目的。当毕赤酵母工程菌进入诱导表达阶段时，通过对生物反应器流加诱导剂，使菌体快速表达目的产物；但此时最理想的发酵控制状态，还应该保持工程菌一定的比生产速率，从而使目的产物的表达量不致于降低。

3.2.2 依据发酵体系内营养物质浓度变化控制 通过测定发酵体系中某些营养物质的浓度，以此为依据来调节流加补料的体积、速度、时间及补料方式。目前，通过离线检测或在线检测不同营养物质的浓度变化来反映菌体的生长情况，从而采取相应的策略调整发酵过程中的参数和补料情况。如检测培养液中的甘油（或葡萄糖）的含量和菌体的生长情况来综合分析与评价，做出相应的调节；再如通过检测培养基中甲醇浓度来调节甲醇流加的速度等。但这种调控策略的生产成本较高，还没有得到广泛应用[17]。

过程优化是发酵工程的基本问题，其目的是最大限度地提高目标产品的生产效率。随着计算机技术在发酵工程领域的广泛应用，以及各种电极和检测技术的发展，人们正不断尝试把计算机技术、检测手段、各种数学算法及理论应用于发酵工程过程控制与优化领域中[18]，如遗传算法、神经网络控制理论、模糊控制理论等已运用于培养基的优化、数学模型的参数估算及最优控制轨迹计算等。近年来，这些先进的理论和技术也逐渐被运用到发酵产品的生产实践中去。

4 结语

毕赤酵母表达系统作为一种低等真核表达系统，具有诸多优点，适合于工业化大规模的发酵生产，相信随着研究的深入和应用的广泛，其在生物制药领域将发挥越来越重要的作用。但目前来看还存在一些问题，例如在高密度菌体发酵的条件下如何在提高目的产物高效表达的同时，找到有效防止目的产物降解的办法；采用何种补料方式，既能满足菌体的生长，又可为基因表达提供足够的动力；以及如何避免在生产过程中潜在的安全问题等。

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