造血微环境的细胞和分子机理

刘佳佳 张亦婷 彭航 刘鹏霞

1978年，Schofield首次提出了干细胞壁龛（niche）的概念［1］。壁龛是一个生态学术语，有机体的壁龛是指有机体生存的地方、有机体所从事的行为，以及有机体与环境相互作用的方式的总称。干细胞的增殖分化行为一方面由自身的遗传特征决定；另一方面受其所处的微环境（壁龛）的影响。所谓造血微环境是指造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）存在于其中的一群组织细胞和细胞外基质，它们分泌多种信号分子，控制着HSC的自我更新和祖细胞的产生［2］。已经证实，造血微环境失调会引起多种疾病的发生，包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征和原发性骨髓纤维化等［3-5］。另外，有报道显示，异体HSC移植后会引起供体细胞白血病，显示造血微环境在血液肿瘤发生中有重要作用［6］。因此，阐明造血微环境的细胞组成和分子机制对于了解白血病发病机理和更好地将HSC用于临床治疗有重要意义。

1 造血微环境的细胞组成

骨髓是HSC在成体中定居的主要部位，也是造血微环境所在的部位。在骨髓中，HSC进行自我更新和分化，一方面保持一定数目的HSC存在；另一方面则不断补充人体循环血液中的血细胞。已有数据显示，骨髓造血微环境可以分成两部分：骨内膜微环境（邻近成骨细胞）和血管微环境（邻近血窦）。目前已知参与构成造血微环境的细胞有：成骨细胞、内皮细胞、CAR细胞、nestin+细胞、破骨细胞、巨噬细胞和施万细胞。

1.1 成骨细胞

成骨细胞是构成骨内膜微环境的主要组成细胞［7］。早期的研究显示纯化的成骨细胞能支持粒细胞生成以及HSC的存活和增殖［8，9］。之后，研究者证实成骨细胞参与HSC的功能调节［9-11］。Zhang 等［10］的研究指出，排列在骨表面的N-钙黏素阳性CD45阴性的梭形成骨细胞（spindle-shaped N-cadherin+CD45-osteoblastic cells，SNO细胞）是造血微环境的组成细胞，SNO细胞数目的增加与HSC数目的增加直接相关。Calvi 等［11］的研究中应用甲状旁腺激素相关肽（parathyroid hormone related peptide，PTHrP）增加了成骨细胞的数目，继而使造血增加。此外，体内试验中发现表达疱疹病毒胸腺嘧啶基因的成骨细胞缺陷的转基因鼠中，造血抑制严重［12］。以上研究说明一部分成骨细胞亚群是造血微环境的组成细胞。但是，后续研究发现纯化的CD150+CD48-CD41-Lin-HSC不表达N-钙黏素，而N-钙黏素被认为是HSC与成骨细胞相互作用的信号分子［13，14］。这些数据显示，SNO细胞可能是通过调节其他微环境成分的功能间接影响HSC。

1.2 内皮细胞

内皮细胞是血管微环境的主要组成细胞。研究发现HSC动员时，静止的HSC会离开骨内膜造血微环境，向骨髓中央迁移，到达血管区，在那里重建造血［15-17］。因此，研究者提出骨髓中存在第二个特化的造血微环境，即血管微环境。

骨髓切片的组织化学检测显示，骨髓血窦的有孔内皮处存在具有长期增殖能力的CD150+HSC［18］。单独输注内皮祖细胞能够促进全身辐照小鼠的HSC重建、增强其造血功能，显示微血管的修复与造血重建相关［19，20］。此外，有人发现特异性敲除血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的成年小鼠，在接受致死剂量辐照后不能重建造血［21］。而选择性的激活成年小鼠内皮细胞中的Akt1，会增加HSC数目、加速辐照后的造血重建［22］。说明内皮细胞是造血微环境的组成细胞。但是，迄今为止的研究并不能排除内皮细胞通过调节造血微环境中其他的组成成分来间接地增强HSC的增殖能力的可能。

1.3 CAR细胞

骨髓血窦内皮细胞周围包围着高表达CXCL12的网状细胞，即富含CXCL12的网状细胞（CXCL12 abundant reticular cell，CAR细胞），研究者发现这群细胞也参与了血管微环境的组成［23-28］。CAR细胞高表达血管细胞黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），CD44，CD51和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）受体，是一群性质相对均一的细胞；HSC、淋巴系祖细胞和红系祖细胞增殖需要CAR细胞，CAR细胞敲除小鼠的HSC数目减少［26，27］。这些证据都说明CAR细胞是造血微环境的组成细胞。

1.4 nestin+细胞

Méndez-Ferrer等［29］的研究发现，在骨髓中nestin+细胞分布于血管周围，在体内许多HSC和肾上腺素能神经元紧邻nestin+细胞生长；nestin+细胞敲除的小鼠中，HSC数目显著减少；将HSC移植给致死剂量辐照的小鼠后，可见HSC归巢到了nestin+细胞处，而将HSC移植给nestin+细胞敲除并接受致死剂量辐照的小鼠后发现，HSC骨髓归巢减少；显示nestin+细胞是血管微环境的组成细胞。这一研究还发现nestin+细胞中包含间充质干细胞和CAR细胞，说明间充质干细胞也是构成血管微环境的组成细胞。侯瑞琴等［30］将间充质干细胞联合HSC移植到患者体内发现，联合间充质干细胞移植能明显改善单倍体相合异基因HSC移植患者骨髓微环境的损伤状态。这一研究进一步证实了间充质干细胞是造血微环境的组成细胞。

1.5 破骨细胞

Kollet等［31］的报道指出破骨细胞可以通过降解骨内膜的成分，从而促进HSC的动员。Adams等［32］则发现破骨细胞释放大量羟基磷灰石钙，这些羟基磷灰石钙与HSC上表达的钙离子受体相互作用，调控HSC功能。用二磷酸盐处理小鼠破坏其破骨细胞功能后，与对照组相比，试验组小鼠造血功能恢复较缓慢，说明破骨细胞影响了HSC的功能［33］。以上证据显示破骨细胞是造血微环境的组成细胞。

1.6 巨噬细胞

研究表明，骨组织中的巨噬细胞对骨内膜处的成骨细胞的功能具有调节作用［34］。在研究粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）对HSC动员作用的试验中发现，给予G-CSF减少了支持成骨细胞功能的骨内膜巨噬细胞的数量，导致骨内膜成骨细胞减少，抑制了骨内膜骨形成，并降低了与HSC滞留在骨内膜微环境中相关因子及HSC自我更新相关因子的表达［35］。后续试验发现，骨髓单核吞噬细胞的减少促进了造血干/祖细胞动员，主要是由于单核吞噬细胞的减少会导致骨髓中CXCL12水平降低，以及那些与HSC滞留在骨内膜Nestin+微环境中相关的基因选择性下调［36］。以上研究表明，巨噬细胞对于维持骨内膜HSC微环境起着重要的作用。

1.7 施万细胞

Yamazaki等［37］的试验表明，神经胶质细胞中的一种细胞——无髓鞘施万细胞也是造血微环境的组成细胞，在骨髓中施万细胞与HSC相邻，施万细胞能够产生转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）， 通 过 与 HSC 表 面 的 TGF-β 受体作用，调控HSC滞留在骨内膜微环境和HSC的自我更新。这一研究小组之前的研究工作已经发现，细胞因子诱导的脂筏聚集促进HSC进入细胞周期，而TGF-β能够抑制细胞因子介导的脂筏聚集，进而使HSC处于静止状态［38，39］。以上试验证实，神经胶质细胞通过分泌TGF-β调控HSC在骨髓微环境中保持休眠状态。

2 造血微环境和HSC之间相互作用的信号通路

在体内，大部分HSC保持静止状态［40］。不同机体条件下，HSC的自我更新、增殖和分化的相对平衡由微环境进行调控。目前已知，HSC和造血微环境组成细胞之间存在以下信号通路。

2.1 CXCL12/CXCR4信号通路

造血微环境中的基质细胞能够分泌趋化因子CXCL12，即基质细胞衍生因子1（stromal derived factor 1，SDF-1），CXCL12能够与HSC表面的CXCR4结合。应用CXCR4拮抗剂后，外周血中HSC数目增加，显示CXCL12/CXCR4信号通路参与调控HSC处于静止状态［41，42］。此外，应用CXCL12抗体和CXCR4抗体能够显著降低HSC的归巢［43］。显示这一信号通路与HSC的静止状态的维持和归巢相关。

2.2 Notch信号通路

研究显示，造血微环境中的成骨细胞表达配体Jagged，当配体结合HSC表面的Notch受体后Notch信号通路激活，Notch发生蛋白裂解，导致Notch的细胞内结构域转运到核内，在核内Notch直接作为转录激活物起作用，促进HSC的自我更新［9，44］。体外和体内试验均显示，在重组活化基因1（recombination activation gene-1，RAG-1）缺陷的Lin－SCA1＋祖细胞中过表达Notch1，会导致HSC和造血祖细胞数目增多［45］。但是在失去功能的研究中发现，敲除鼠Notch-1、Notch-2和Jagged-1并不影响HSC和微环境的功能［46，47］。这提示可能有其他信号通路发挥同样的作用。

2.3 Wnt信号通路

已知Wnt信号通路至少有两个路径：经典的Wnt/β-连环蛋白通路和非经典的Wnt/钙离子通路［48］。经典的 Wnt信号通路促进 HSC 自我更新［49］。非经典的Wnt信号通路也能够促进HSC自我更新，但是这一作用是通过抑制经典的Wnt信号通路而完成的，具体机制还不清楚［50］。此外，研究发现Wnt信号通路对于HSC静止状态也有影响，Heather等［51］通过体内试验发现，抑制HSC的Wnt信号通路会导致HSC中p21Cip1表达下降以及移植后造血再生能力下降，这显示Wnt信号通路也与限制HSC增殖以及维持HSC的造血重建功能相关。另外，有研究显示Wnt信号通路与Notch信号通路之间存在整合，协同调控着 HSC 的功能［52，53］。

2.4 Tie2/Ang-1信号通路

骨髓中处于细胞周期静止期并具有抗凋亡活性的HSC表达酪氨酸激酶受体2（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains-2，Tie2），与成骨细胞表面表达的Tie2的配体血管生成素1 （angiopoietin-1，Ang-1）结合后，能够使HSC紧密黏附于微环境基质细胞，进而保持静止状态［54］。同源筛查发现Tie2的另一个配体Ang-2是Ang-1的拮抗物，Ang-2会逆转Tie2/Ang-1信号通路调控HSC功能的作用［55］。具体机制还有待进一步的研究。

2.5 BMP/TGF-β信号通路

骨形态发生蛋白（bone morphogenic protein，BMP） 是 TGF-β家 族 成 员 之 一。BMP-4调 控 着HSC的数目和功能［56］。体外培养中发现，高浓度BMP-2、BMP-4和BMP-7能够维持HSC处于未分化状态，而低浓度BMP-2、BMP-4和BMP-7促进HSC增殖和分化［57］。体内试验发现，特异性敲除小鼠的BMP受体ⅠA后，排列在骨表面的成骨细胞数目增加，从而导致微环境中HSC数目增加［10］。显示BMP信号通路通过调节造血微环境中成骨细胞的数目而调控HSC。

2.6 Hedgehog信号通路

Trowbridge等［58］研究发现，激活 hedgehog信号通路会导致大量HSC进入细胞周期，持续激活hedgehog信号会导致HSC耗竭，显示hedgehog信号通路调控HSC处于静止状态。但是，也有研究者发现hedgehog信号通路对于HSC功能的维持不是必须的［59，60］。具体的机理还需进一步的研究来证实。

3 结语

自从提出造血微环境的概念以来，对造血微环境的研究已经取得了许多成就。然而，组成造血微环境的细胞种类比较多，细胞间信号通路比较复杂，还有许多问题有待进一步研究。例如：目前还不清楚组成造血微环境的细胞的种类究竟有多少；不同细胞之间是否有相互作用。已经知道有些细胞，如巨噬细胞是通过作用于成骨细胞来影响HSC功能的，对于这类细胞的研究还比较少。此外，HSC和微环境之间存在多种信号通路，这些信号通路之间是如何整合调控HSC的也不清楚。阐明这些问题是在体外培养、扩增HSC，进而将HSC用于再生医学的基础。

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