共生菌Cardinium 在宿主体内的分布、检测及其生殖调控作用

任素丽，孙秀新，薛 夏，任顺祥，邱宝利

(华南农业大学昆虫学系，广州 510640)

在自然界中，节肢动物与微生物的共生现象普遍存在。经过长期的协同进化，节肢动物与其体内的微生物形成了密切的共生关系，细菌与其宿主相互依赖、相互影响、协同进化(Douglas，1998)。目前大约75%的节肢动物体内含有共生菌，根据其在宿主体内的分布位置，共生菌被分为内共生菌与外共生菌，其中共生于节肢动物细胞内的细菌被称为“内共生菌”(endosymbionts)(高辉华，1988)。研究表明，内共生菌可以向宿主提供食物中缺乏的营养物质，调控宿主的生殖方式，对宿主的种群进化以及与其他生物间的生态互作都起着重要作用(Camargo ＆ Freymuller，1977;Stouthamer et al.，1999;Russell ＆ Moran，2006)。根据内共生菌在宿主体内的分布位置和宿主的进化关系，内共生菌又可以分为原生共生菌(也称初生共生菌，primary endosymbionts)和次生共生菌(secondary endosymbionts)。

昆虫是节肢动物门中最大的一个类群，目前在昆虫中研究相对较多的原生共生菌主要包括寄生在蚜虫中的Buchnera、粉蚧中的Tremblaya 以及粉虱中的Portiera 等。一般来讲，在一种昆虫体内其感染的原生共生菌往往只有一种，分布在含菌细胞等特化的宿主细胞内，与宿主有协同进化关系，在宿主世代间进行垂直卵传(Buchner et al.，1965);而昆虫体内次生共生菌的种类比原生共生菌丰富，已报道的有 Wolbachia、Rickettsia、Cardinium、Arsenophonus、Spiroplasma(Duron et al.，2008a)等，且一种昆虫可以同时感染多种共生菌(Douglas，1998)。次生共生菌分布在多种宿主细胞里且感染时间较短，并且不仅可以垂直卵传，还可以水平传播(Baumann et al.，1995)。原生共生菌可以为宿主提供食物中缺乏的必需氨基酸、维生素等物质(Wu et al.，2006)，而次生共生菌目前被认为与其宿主的生殖繁育有密切关系。此外，也有一些报道认为次生共生菌的存在可以提高宿主的抗逆性、增强宿主昆虫的适应能力、帮助宿主防御天敌昆虫的寄生与捕食等功能(Douglas，1998;Siozios et al.，2008)。

节肢动物体内次生共生菌中研究最深入的是α-变形菌门的Wolbachia，至少有近百万种节肢动物被其感染(Xie et al.，2010)。Wolbachia 能诱导多种生殖异常，如细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility，CI)(Bourtzis et al.，1996)、产雌孤雌生殖(parthenogenesis inducing，PI)(Stouthamer et al.，1993)、雌性化(feminizing)(Rousset et al.，1992)、杀雄作用(male killing)(Hurst et al.，1999)等。以前认为引起这些生殖异常是Wolbachia 的“专利”。然而近几年又新发现了一种能引起宿主生殖异常，具有与Wolbachia相似功能的一种共生菌。这种菌是2001年Weeks et al.在紫红短须螨Brevipalpus phoenicis 宿主中发现的，其能引起紫红短须螨的雌性化，是一种拟杆菌门的内共生体(Weeks et al.，2001;Weeks ＆Breeuwer，2001)。这类菌为革兰氏阴性菌，呈杆状，最显著的形态特征就是在胞内呈平行排列的微丝状结构(microfilament-likestructures，MLS)，且其在宿主中趋向于群集(Zchori-Fein ＆Perlman，2004;Nakamura et al.，2009)。此后，将存在于多种节肢动物中的这类菌命名为Cardinium(Weeks et al.，2003;Zchori-Fein et al.，2004)。Chang et al.(2010)等在一些盲蜘蛛(daddy long-legs)体内发现一种Cardinium 新的进化分支;Dallai et al.(2011)在原尾目的Acerella muscorum中也发现了Cardinium 共生菌的存在。

随着研究的不断深入，人们发现Cardinium 可以通过提高它的初级宿主蚜小蜂的产卵量来增强自己的传播力(Kenyon ＆ Hunter，2007)。寄生蜂感染Cardinium 后对其生物学特性的影响是多方面的，例如，感染共生菌后寄生蜂的产卵量降低，但同时能提高寄生蜂的存活力;然而当寄生蜂中同时感染多种共生菌时，对宿主本身却没有了影响，这可能是共生菌间相互作用的结果(White et al.，2011)。初步推测，Cardinium 有不同的进化分支且宿主种类可能非常广泛，但目前对Cardinium 在不同宿主中的分布、传播规律、生物学及生态学特性等方面了解至少。本文基于目前国内外的有关研究文献，对Cardinium 的研究进展进行了综述，以期引起更多学者对该共生菌的关注，并推进对该共生菌的研究与应用。

1 Cardinium 在节肢动物内分布

研究表明，Cardinium 在节肢动物中广泛存在，目前已知其宿主范围包括蛛形纲的6个目，即蜘蛛目、中气门目、蜱目、甲螨目、前气门目和无气门目，昆虫纲的5个目，即同翅目、半翅目、双翅目、啮虫目和膜翅目(张开军等，2010)。已经报道感染Cardinium 的节肢动物有介壳虫(Provencher et al.，2005)、蜱虫(Morimoto et al.，2006)、粉虱、叶蝉(Marzorati et al.，2006)、蜘蛛(Pekar ＆ Sbotnik，2007;Duron et al.，2008a，b;Martin ＆ Goodacre，2009;Perlman et al.，2010;Chang et al.，2010)、寄生蜂和螨类(Hunter et al.，2003;Gotoh et al.，2007;Ros ＆ Breeuwer，2009)。Liu et al.(2006)调查了中国27个朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus 地理种群中Cardinium的感染情况，结果有6个地理种群感染。Liu et al.(2010)对山西和甘肃80 头螨进行双重感染检测时发现，Cardinium 的单菌感染率为45%～60%。据已有的文献报道，估计约有6%～7%的节肢动物感染了Cardinium(Weeks et al.，2003;Zchori-Fein ＆ Perlman，2004)，但由于调查检测方法不同(不同物种检测的样本数量不一样、检测选取组织的差异、检测方法的灵敏度等)，部分宿主感染率调查结果的准确性有待进一步的验证。

Cardinium 不仅宿主范围广，在同一宿主内还可分布于不同的组织和器官内，例如在短须螨Brevipalpus spp.体内的很多部位，如表皮、复眼、卵母细胞、卵、盲肠上皮细胞和神经细胞等都能发现Cardinium(Kitajima et al.2007.);有 报 道Cardinium 存在于葡萄带叶蝉Scaphoideus titanus 的脂肪体中(Sacchi et al.，2008)，并推测其可能参与宿主的生理代谢。在原尾目的Acerella muscorum虫体的中肠和后肠，第八腹节的分泌腺细胞，表皮细胞以及输精管细胞都存在类Cardinium 内共生菌(Dallai et al.，2011)。Cardinium 的数量也因宿主的不同部位而存在明显差异，例如在一种四索跳小蜂Plagiomerus diaspidis 的卵巢原卵区，其感染量就明显高于滤泡细胞和成熟卵(Matalon et al.，2007)。Cardinium 的数量因宿主的组织器官处于不同时期而不同，如在原尾虫Acerella muscorum 精巢的大型顶端功能细胞里共生菌很少，但是在生殖周期快结束时其顶端功能细胞会出现许多内共生菌，并能观察到微管状结构的Cardinium 存在(Dallai et al.，2011)。Cardinium 的量也与其宿主所处的环境有关，例如在库蠓(Culicoides imicola，C.oxystoma and C.schultzei)的早期发育阶段，其体内Cardinium 的感染率受地表温度影响较大，以色列干旱地区的库蠓体内感染率最低，而在靠近地中海的潮湿地区感染率最高(Morag et al.，2012)。

2 节肢动物体内的Cardinium 及其检测

2.1 Cardinium 的传播规律

目前已知，Cardinium 以卵母细胞垂直传播(vertical transmission)作为其在宿主世代间传递的基本模式。Perlman et al.(2008)通过研究感染Cardinium 的寄生蜂E.pergandiella 自然种群证明，Cardinium 的母系遗传效率很高，同时证实了该菌不能通过父系遗传。Duron et al.(2008b)的研究结果证实了感染Cardinium 的一种蜘蛛Holocnemus pluchei 自然种群，Cardinium是母系遗传的。虽然很多研究表明，Wolbachia 等共生菌在其宿主不同个体甚至不同种属间可能还存在着水平传播(horizontal transmission)的 现 象(Vavre et al.，1999;Russell et al.，2003)，但对Cardinium是否同样存在有水平传播现象，尚有待于进一步研究。但近几年的研究表明宿主和寄生物之间的系统发育不一致，这暗示着Cardinium 存在有在不同种群之间水平传播的可能性(Chang et al.，2010;Steve et al.，2010;Ros et al.，2012)。

2.2 Cardinium 的分子检测

随着分子生物学的快速发展，以聚合酶链反应技术(PCR)为基础的分子检测技术越来越成熟，利用PCR 技术对Cardinium 进行分子检测。检测时，首先提取宿主的基因组DNA，然后利用设计的Cardinium 16S rDNA 特异引物进行PCR 扩增，扩增完成后，取1～2μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，最后在凝胶成像系统下观察，检查凝胶中是否存在有特异的目标条带，进而推断宿主体内是否存在Cardinium 感染;将有目标条带的PCR 扩增产物进行DNA 测序，并在GenBank中比对，可进一步确定Cardinium 共生菌的存在。

目前已知的Cardinium 由16S rDNA 序列设计的特异性引物有多对，使用较多有3 对，第一对是Car-sp-F:5'-CGGCTTATTAAGTCAGTTGTGAAATCCTAG-3'和 Car-sp-R:5'-TCCTTCCTCC CGCTTACACG-3'(Nakamura et al.，2009);第 二 对是CARf:5'-TACTTTACACTGGGGAATAGC和CARr:5'-GTCGC TGGTCTAACACTAAACA(Liu et al.，2006);第三对是 Ch-F:5'-TACTGTAAGAATAAGCACCGGC-3'和Ch-R:5'-GTGGA TCACTTAACGCTTTCG-3'(Zchori-Fein et al.，2004)。

3 Cardinium 对宿主的生殖调控

作为一种细胞内共生菌，Cardinium 之所以引起越来越多学者的研究兴趣，除了因为其在节肢动物中分布广泛之外，还有一个非常重要的原因就是Cardinium 能够对其宿主的生殖行为起到一定的调控作用。

已有的研究表明，Cardinium 对宿主的生殖调控主要体现在细胞质不亲和(Hunter et al.，2003)、产雌孤雌生殖(Zchori-Fein et al.，2001;Zchori-Fein ＆ Perlman，2004;Provencher et al.，2005)和雌性化(Kenyon ＆ Hunter，2007)等几个方面，除此之外，其还能影响宿主的适合度和改变宿主的产卵行为等。

3.1 细胞质不亲和作用

细胞质不亲和(cytoplasmic isolation，CI)是昆虫体内感染不同特性类型的共生菌而引起的宿主发育缺陷，具有不同细胞质的雌雄个体在交配后表现出不同程度的后代不育现象。胞质不亲和有两种表现类型:雌性死亡型CI(Breeuwer，1997;Vavre et al.，2000)和雄性发育型 CI(Breeuwer ＆ Werren，1990)。胞质不亲和的细胞发生机制在尖音库蚊Culex pipiens、果蝇和寄生蜂中都有所研究，且首次报道的CI 现象见于尖音库蚊体内。在尖音库蚊、果蝇和寄生蜂受精卵中，CI都与有丝分裂前期的故障有关系。至今为止，已报道Cardinium 感染能引起宿主细胞质不亲和的例子还包括恩蚜小蜂E.pergandiella(Hunter et al.，2003;Zchori-Fein et al.，2004)、西方盲走螨Metaseiulus occidentalis(Weeks ＆ Stouthamer，2004)、桑始叶螨 Eotetranychus suginamensis(Gotoh et al.，2007a)和苔螨Bryobia sarothamni(Ros ＆ Breeuwer，2009)等。在恩蚜小蜂E.pergandiella 的有性种群中，未感染Cardinium 的雌虫和感染的雄虫交配后，几乎不能产生可存活的后代，而感染的雌虫和感染的或不感染的雄虫交配后都能产生可存活的后代，因此与感染Cardinium 的雌虫相比，不感染的雌虫在生殖方面就处于劣势地位(Hunter et al.，2003)。Perlman et al.(2008)对恩蚜小蜂 E.pergandiella 中Cardinium 能够诱导胞质不亲和现象进行了更进一步的证实，并发现田间恩蚜小蜂E.pergandiella 中Cardinium 感染率高达92%。Gotoh et al.(2007a)发现E.suginamensis 感染的Cardinium 也能引起CI，CI 的表现为后代的孵化率降低。Harris et al.(2010)发现Cardinium 在蚜小蜂各个种群中快速传播，然而在一些种群中Cardinium 的感染频率远远低于预测的侵染阈值频率，这可能是由于CI 的能力比在理想感染环境下弱。最近的一项研究表明在西方盲走螨Metaseiulus occidentalis 体内的Cardinium 诱导单向生殖不亲和(Wu et al.，2012b)。Ros ＆ Breeuwer(2009)发现苔螨Bryobia sarothamni 体内的Cardinium 能诱导宿主产生CI，推测CI 可以促进或强化不同种群间的生殖隔离，因此可以推断，Cardinium 在物种形成过程中具有一定的重要性(Bourtzis ＆ Neill，1998)。朱砂叶螨中Cardinium 引起CI 作用的强弱主要与雄虫日龄和Cardinium 的含量有关，且与Cardinium 含量呈正相关，随雄虫日龄的增长而减弱，并在雄虫日龄12 天时Cardinium 不能再诱导CI 作用(Xie et al.，2010)。在以后的研究中找到一个Cardinium能诱导CI 的阈值含量是很必须的。

到目前为止，研究发现Cardinium 只能引起雌性死亡类型的CI。由于在上述螨类中，Cardinium诱导的CI 仅降低了雌螨后代孵化率，没有发现CI引起雄性性比增加的现象，所以还不能确定Cardinium是否能引起雄性型(刘颖等，2010)。当然，细胞质不亲和现象可以受生物因子与环境因子，如宿主类型、宿主龄期、交配频率、温度、共生菌互作等多个方面的影响，甚至在同一物种的不同种群或同一种群的不同个体间的表现也会有差异(Gotoh et al.，2007b)。

3.2 诱导产雌孤雌生殖

孤雌生殖(parthenogenesis)也称单性生殖，是指卵不经过受精也能发育成正常的新个体。孤雌生殖可分为产雄孤雌生殖(arrheotoky，AY)和产雌孤雌生殖(thelytoky，TY)。Cardinium 诱导的产雌孤雌生殖，产雄孤雌生殖仅在螨、膜翅目昆虫和蓟马中被发现(Stouthamer et al.，1990;Arakaki et al.，2001;Weeks ＆ Breeuwer，2001)。Cardinium 的产雌孤雌生殖是在膜翅目的单双倍体系统中，被Cardinium 感染后能使宿主的单倍体雄性卵转变为二倍体雌性卵，而Cardinium 诱导孤雌生殖的生理机制至今尚未有深入的报道。

恩蚜小蜂E.pergandiella 的产雄孤雌生殖种群是从在宿主体内产卵后便开始形成的(Hunter ＆Woolley，2001)，即雌蜂将受精卵产在粉虱若虫体内时产生的后代是雌性，未受精卵产在粉虱体内的寄生蜂蛹内(次级宿主)时产生的后代是雄性，然而产在非适宜宿主体内的卵则不能发育，这是一种专性的、性别特异的宿主关系。在感染了Cardinium 的营产雌孤雌生殖的E.pergandiella种群中，雌蜂产在初级宿主内的未受精卵全部发育成雌蜂，而产在次级宿主内的卵却不能发育成雄性成蜂(Zchori-Fein et al.，2001)。Zchori-Fein et al.(2004)证实了Cardinium 感染与寄生蜂Encarsia hispida 的产雌孤雌生殖有关，未经过抗生素处理的只产生雌性后代，而经抗生素(利福平)处理后则只产生雄性后代。对E.hispida 体内共生菌16S rDNA 基因测序表明，该基因全长为1487bp，与恩蚜小蜂E.pergandiella 体内诱导孤雌生殖的共生菌的同源性为99%;同时，利用细菌通用引物的分子检测确定Cardinium是E.hispida体内唯一存在的内共生菌，从而证明E.hispida 生殖方式的改变是由感染Cardinium 引起的。

孤雌生殖的优势在于单性生殖可以避免寻偶交配问题，从而能够以较低的密度繁衍种群，形成较高的种群增长率。因此Cardinium 可以通过诱导宿主孤雌生殖，降低其生殖消耗，扩大宿主种群，有利于自身在短期内迅速传播。

3.3 诱导雌性化

雌性化是指个体基因型为雄性，但表型却为雌性。Cardinium 能引起宿主雌性化最早是在紫红短须螨 Brevipalpus phoenicis Geijskes 中发现的(Weeks et al.，2001)。Cardinium 可以引起短须螨属的多个种的雌性化，抗生素处理或钴60 照射可以消除Cardinium 的这种作用:一般情况下，短须螨属产生雄性后代的概率很低。用抗生素处理短须螨属可以改变其子代雄性比例。钴60 照射也可以有效消除Cardinium 并提高雄虫比例(Novelli et al.，2008)。Giorgini et al.(2009)在寄生蜂E.hispida 中还发现了一个奇怪的现象，用抗生素除去Cardinium 的寄生蜂产生的后代几乎全是雄性，然而这些雄性后代与雌虫有相同的染色体倍数，都是双倍体，这也是首次在恩蚜小蜂属Encarsia 寄生蜂中发现的双倍体雄虫。雌性化的存在，则为性别决定上的遗传竞争创造了潜在条件，将导致在性别决定系统上的快速进化。

3.4 Cardinium 对宿主适合度的影响

目前资料表明，Cardinium 除了对节肢动物宿主起生殖调控作用外，对宿主种群的适合度也有不同程度的影响。适合度(fitness)是指昆虫等生物在生存环境中能生存并把它的特性传给下一代的相对能力，一般包括生活力和繁殖力等;生活力一般以成活率、寿命、生长发育速度表示，繁殖力则以产生后代的数量表示。在西方盲走螨Metaseiulus occidentalis 中，Cardinium 的感染使雌虫的繁殖率提高将近50%(Weeks ＆ Stouthamer，2004)，表明Cardinium 的感染能提高该物种的适合度。Wang et al.(2008)用利福平去除嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila 体内的Cardinium，其后代的存活率和产卵量都低于感染品系，由此可见，Cardinium 的感染能够提高该物种的适合度。

4 应用与展望

综上所述，Cardinium 的节肢动物宿主十分广泛，感染Cardinium 可以诱导宿主生殖异常:胞质不亲和，产雌孤雌生殖、雌性化等。Cardinium 不仅能够调控宿主的各种生殖方式，而且能够对宿主的适合度具有不同程度的影响。Cardinium 整个发育过程都在宿主体内完成，对宿主生活史具有有重要影响。当前，Cardinium 能够影响宿主适合度的现象已引起人们的关注，然而许多问题尚需进一步的研究，如Cardinium 对宿主适合度是否产生负面影响等。另一方面，迄今为主Cardinium 的作用都是通过反证法，即通过比较感染治愈后和治愈前的差异得出，还没有通过正向法，即通过比较接种前和接种后的表型差异来确认。尽管如此，深入了解Cardinium 感染情况及其对感染宿主的作用，仍被期望在今后的害虫防治与益虫利用中发挥作用。

节肢动物体内普遍存在的另一种共生菌是Wolbachia，其感染没有改变宿主基因表达，仅是诱导或抑制宿主体内的免疫反应。与研究相对全面的Wolbachia 相比，Cardinium 感染宿主可以诱发多种免疫反应，包括诱导抗菌肽、模式识别受体和丝氨酸蛋白酶激活等(Nakamura et al.，2011)。对于不同的宿主免疫反应，可能是因为Cardinium 与Wolbachia 有不同的细胞壁结构，因为前者缺乏编码脂多糖和合成肽聚糖的两个消旋酶基因，也可能是一些非免疫相关基因的差异表达。长时间使西方盲走螨雌虫处于饥饿状态，能消除虫体内的 Wolbachia 但是不能够消除Cardinium，所以Wolbachia 的作用依然有待更深入研究(Wu et al.，2012a)。同一宿主同时感染Wolbachia和Cardinium 在自然界是很常见的，但在双重感染的宿主中获得单感染的共生菌比较困难，Zhang et al.(2012)用显微注射青霉素G 的方法在白背飞虱种群中获得单感染Wolbachia 或Cardinium种群。最近一项有关红蜘蛛Tetranychus piercei 的研究表明其体内的Wolbachia和Cardinium也都能诱导CI，但Wolbachia 引起的CI 能力比较弱，而Cardinium 则能引起强烈的CI。Wolbachia和Cardinium 引起的CI 彼此间不能营救，但是Wolbachia 能增强Cardinium 的CI 作用(Zhu et al.，2012)。然而以前对Wolbachia和Cardinium 的研究有许多不同见解，因为有研究表明在苔螨B.sarothamni 中是Cardinium 引起的 CI，不是Wolbachia(Ros ＆ Breeuwer 2009);而在寄生蜂中则是Wolbachia 引起CI，不是Cardinium(White et al.，2009);还有一项研究发现这两种菌都没引起细胞质不亲和作用(Gotoh et al.，2007)。以上这三种研究结果大不相同，所以，尚有许多问题有待有待于众多学者进一步的研究和探索。

共生菌Cardinium 与Wolbachia 有很多相似之处，二者都是通过细胞质遗传，且都能通过诱导胞质不亲和、孤雌生殖和雌性化调控宿主的生殖方式。有文献指出，不久的将来可以把Wolbachia诱导的CI 作为控制害虫与疾病的一种工具(Bourtzis，2008)。Zabalou et al.(2009)认为，可以利用Wolbachia 诱导宿主CI 的特性，扩大工程昆虫的种群，建立感染Wolbachia 的种群，用一种类似释放不育雄性的方法能减少有害昆虫种群的生殖能力;因为孤雌生殖能提高种群增殖率和产卵量，Wolbachia 诱导其宿主孤雌生殖(PI)的性能也可能应用于生物防治上。若PI 能在天敌生物种间进行转移，那么这种内共生菌将大大增强其天敌的生物防治潜能(Allen et al.，2007)。如西方盲走螨感染Cardinium 后其生殖力提高，繁殖速率加快，从而提高了天敌害虫的控制害虫的潜力(week et al.，2004)。

综上所述，尽管目前对Cardinium 细胞质不亲和作用研究的比较多，而相对于产雌孤雌生殖、雌性化、多重感染及适合度研究比较少，但不能否认的是对Cardinium 共生菌的研究及利用将会在今后的害虫生物防治领域产生积极的影响。相信随着对Cardinium 共生菌研究的不断深入，利用Cardinium 在天敌昆虫保护、农业害虫综合防治中的应用价值也将越来越被人们所重视。

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