急性毒性试验研究进展

袁 媛，邱 霞

急性毒性试验(acute toxicity test)是大剂量高浓度药物1次给予试验动物，目的是了解外源性化合物短期内的毒性作用，并对诊断、预防和急救治疗提供科学依据。现就急性毒性试验的研究进展作一综述。

1 对半数致死量(LD50)的重新评价

毒理学家通过长期实践，发现同一化合物，用同一品系动物，同样的实验条件和方法，却得出不同的LD50值，甚至相差几倍。LD50实际上是对试验动物结果进行数学处理后计算产生的一个数值。毒理学评价应具备中毒表现、出现中毒和持续的时间，毒性涉及脏器的损伤程度、可逆性质、死亡过程及死亡原因等系列毒性资料[1]。实际上急性毒性试验应从定性和定量两个方面进行观察和研究，否则容易造成错误的评价。LD50只是毒性测试的第一步，远不能回答急性试验的全部内容。

2 LD50代替法的兴起

早在1876年英国政府就颁布了“关于禁止虐待动物法”，在《动物实验法则》中明确规定大学毕业经考核合格，持有许可证方可参与或在监督下进行动物实验。1959年，在动物学家William Russell和微生物学家Rex Burch发表的《人道的动物试验技术原则》中提出了应用动物研究的3Rs原则，即替代(replace)、减少(reduce)和优化(refine)，即在生命科学研究中应采取其他手段来代替动物实验、改进实验方法、减少动物数量和痛苦，但没有引起世人的重视[2]。 直至20世纪80年代，许多国家成立了代替法组织，并组织了代替法国际会议，北京实验动物学会也成立了该组织，并参加了国际会议。在世界性保护动物组织的压力下，目前各国都在研究LD50代替法，并取得了一定进展，但动物实验无法完全被其他技术所代替，因此尽量减少实验动物用量，将是今后探讨的方向。

3 几种新的急性毒性评价方法

3.1 固定剂量法(fixed dose procedure，FDP) 本法设固定剂量、观察动物反应，不以死亡为依据，而且按毒性症状来判断该物质的危险程度。这样一个试验只需10～20只动物。设5、50、300、2000 mg/kg 4个剂量组，(必要时可以增加至5000 mg/kg)，依次使用同一性别的动物(一般为雌性)，经口染毒。根据预试验结果，确定会发生毒性反应但不产生严重的毒性反应或死亡的剂量作为起始剂量进行试验，再根据观察的结果调整毒性剂量，当出现以下情况时终止试验：(1)出现明显的毒性反应或已确认不多于1只动物死亡；(2)最高剂量未出现毒性反应；(3)最低剂量动物出现死亡。

此法早在1984年由英国毒理学会提出，经布鲁塞尔协议后欧洲委员会出资50万英镑，由美国、日本、欧洲等33个研究室共同进行20个化合物的新旧方法急性毒性试验对比，其毒性分级一致率为87.2%。结果证实可以代替从1927年以来沿用的LD50法，而且为危险度评价提供了对急性毒性所需的足够资料，包括中毒作用性质、中毒发生时间、持续时间和结局等。布鲁塞尔委员会也承认了固定剂量法的实用价值。

3.2 急性毒性分类法(acute toxic class method，ATC) 急性毒性分类法是由Sumiey于1990年提出的一种评估化合物急性毒性的简单方法[3]，每性别每一剂量仅用3只动物，首先用2000 mg/kg剂量，如无死亡即可结束试验，因为LD50一般为最大无致死剂量(MNLD)的2～2.5倍。这意味着化合物在2000 mg/kg剂量时无动物死亡，其LD50大约为400～5000 mg/kg，因此就没有必要进一步做致死剂量的试验。如有死亡则应用200 mg/kg继续试验。用本法估算的LD50与传统的LD50试验结果基本一致。

3.3 上下法(up-and-down procedure，UDP) 上下法作为经济合作与发展组织(organization for economic cooperation and development，OECD)于2001年新修订发布的急性毒性试验方法之一，是传统急性毒性试验的一个替代方法，有着巨大的应用价值和发展前景。

上下法由限度试验和主试验组成。限度试验又分为2000 mg/kg和5000 mg/kg剂量水平，用于受试物毒性可能较小的情况。2种剂量的限度试验具体步骤有细微差别，但最多仅用5只动物。设计限度剂量5000 mg/kg，将受试物按5000 mg/kg给予1只动物。观察48 h，如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外2～4只动物。有3只或3只以上动物存活时，LD50大于5000 mg/kg；有3只或3只以上动物死亡时，LD50小于5000 mg/kg[4]。主试验是一个预先设计的给药程序，在此程序中，每次给药1只动物，若该动物存活，第2只动物给予高一级剂量，若第1只动物死亡或出现濒死状态，第2只动物给予低一级剂量。在对每只给药动物仔细观察48 h后，可以决定是否对下1只动物给药，以及给药剂量。当最高剂量下有连续3只动物存活，或在6只动物中有5只连续发生在高一级剂量死亡、在低一级剂量生存的生死转换等情况时，可以停止试验。根据终止时所有动物的状态，用最大可能性法计算LD50值[5]。

在应用上下法进行急性毒性试验中，起始剂量的设计十分重要。在指导原则中，要求起始剂量的设计比最接近LD50估计值的剂量低一级。这样不但能够减少上下法中使用的动物数量，也可以使得到的试验结果更加准确。除了起始剂量外，组距的确定也对试验结果有较大影响，不同剂量级数因子的选择可以改变LD50及95%置信区间[6]。可以使用最大相似法计算LD50值以及95%置信区间。在整个主试验过程中，剂量级数因子应选定为1/(剂量-反应曲线斜率估计值)的反对数。默认假设通常为1.3(Sigma=0.12)的剂量级数因子适于很广泛的化合物，可以作为大多数化合物的大致估计值，用它进行试验得到的LD50与Sigma在0.05～0.25之间的化合物的LD50均无明显差异，对毒性分级就更加没有影响了[7]。

与传统的急性毒性试验方法相比，上下法具有很多明显的优点，主要表现在以下几方面：(1)符合维护动物福利的要求[8-9]。(2)能够得到LD50的估计值及相应的置信区间[10]。(3)能够观察毒性表现。(4)所需的受试物量少[11]。(5)应用计算机程序进行数据分析，实用性强。

尽管上下法与传统方法相比有了很多改进，但仍存在一些不足。例如：由于试验要求分阶段进行，因此比较耗时[12]；只适用于评价那些染毒后动物在48 h内出现毒性症状并死亡的化学物质的急性毒性，若某受试物估计其染毒的动物发生延迟死亡，则不适用；无法像传统方法那样提供剂量-效应曲线的数据；虽然有效减少了试验动物的死亡数量，但仍然以死亡作为观察的终点，终究要付出动物生命的代价。但有专家预测，由于上下法与不以死亡为观察终点的固定剂量法相比，出现毒性反应的概率接近，因此具有发展为不以死亡为终点的方法的潜力。

目前对农药的安全性评价的主要手段还是动物毒性试验，1995年在东京召开的国际标准实验规范(GLP)协调会议就提出动物毒性试验不测LD50也可以，主要尽可能用少量动物获得更多的急性毒性信息。急性毒性代替方法的建立与应用，能够大量减少试验中所用的动物数量，减少样品消耗，节约试验资源，降低开发成本，保护动物权益[13]。在我国改进经典的LD50测定法也是势在必行。

[参考文献]

[1] 王捷，梁震，刘瑛.急性毒性LD50实验研究的进展[J].农药，2000，39(5)：45-46.

[2] Fleeknell P．Replacement，reduction and refinement[J]．ALTEX，2002，19(2)：73-78.

[3] Sumiey.一种评估化合物急性毒性的简单方法[J].国外医学卫生学分册，1991，(5)：294.

[4] 连勇，徐培渝，孙强.上下法替代实验与Horn′s法测定LD50的试验研究[J].现代预防医学，2008，35(18)：3591-3593.

[5] 李佳，金晶，黄芝瑛.上下法在急性毒性试验中的应用进展[J].中国比较医学杂志，2008，18(6)：70-72.

[6] 张林媛，孙金秀.上下增减剂量法与Horn′s法测定LD50的研究[J].卫生毒理学杂志，2003，17(4)：234-236.

[7] Lipnick RRL, Cotrnvo JA, Hill RN, et al. Comparison of conventional LD50, toxicity the up-and-down, and fixed-dose acute procedures[J]. Fd Chem Toxic, 1995,33(3): 223-231.

[8] Fleeknell P. Replacement, reduction and refinement[J]. ALTEX, 2002,19(2):73-78..

[9] 王捷，张丽姝．对LD50的重新评价[J]．卫生毒理学杂志，2003,14(3)：188-189.

[10] Rispin A，Farrar D，Margosches E，et al．Alternative methods for the median lethal dose[LD(50)]test：the up-and-down procedure for acute oral toxicity[J]．ILAR J，2002，43(4)：233-243．

[11] 秦爱平，袁素波，王全军，等．Z24系列化合物一般毒性的比较研究[J]．军事医学科学院院刊，2007，31(1)：50-53．

[12] Walum E．Acute oral toxicity[J]．Environ Health Persia，1998，106(2)：497-503．

[13] 谭剑斌，赵敏.体内外代替方法在急性毒性评价中的研究进展[J].毒理学杂志，2010，24(6)：479-482．