断奶仔猪肠道屏障功能的研究进展

■徐建雄 盛永帅

（上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240）

小肠上皮细胞主要有3个功能：消化、吸收营养物质；分泌、吸收水分和电解质以维持肠腔内适宜的黏稠度，排出有害物质；抵挡各种毒素及病原微生物。肠道屏障功能损伤导致肠道黏膜通透性增加会加剧细菌或有害物质进入机体，进而引起免疫反应，增加发病率[1-2]。

在大鼠和人类的试验中已证实，各种内源性或外源性应激都会导致小肠屏障功能损伤[3-4]。在畜牧生产中，仔猪早期断奶常常伴随着心理、环境和营养三大应激[5]。仔猪断奶后血浆中皮质醇和促肾上腺皮质激素释放因子浓度上升证实了断奶应激的存在。断奶后大多数仔猪的采食量较低，约10%的仔猪在断奶后48 h内不摄取任何饲料[6]。断奶后低采食量会引起小肠绒毛萎缩、脱落、肠绒毛隐窝增加[7-9]。断奶仔猪极易遭受感染[7]，引发水肿病，这与断奶造成的肠道屏障功能损伤密切相关[10]。断奶后肠组织形态学变化，抗病能力下降和水肿病的出现都表明肠道屏障功能受到损伤。本文介绍了肠道屏障功能的评估方法，综述了仔猪旁细胞屏障及跨细胞屏障的影响因素，以及缓解小肠屏障功能损伤的方法。

1 小肠上皮细胞转运

小肠上皮转运途径可分为旁细胞途径和跨细胞途径。旁细胞途径是指肠腔内物质通过肠上皮细胞之间的紧密连接进入细胞外间隙的过程。紧密连接是一种蛋白质网络，连接肠上皮细胞、密封细胞间隙[11]。它是一种动态调节结构，除有机械连接作用外，更重要的是封闭细胞顶部的细胞间隙，并将表皮与内皮细胞的顶端和基底液体腔室分割开来，阻挡细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内，发挥渗透性调节功能，调节离子与蛋白透过性[12]。跨细胞途径是指肠腔内物质经肠上皮细胞顶端膜进入细胞，再由细胞基底侧膜排入细胞外间隙的过程。包括通过主动及被动吸收小分子物质进入细胞，通过胞吞吸收大分子物质。仔猪出生后通过胞吞作用吸收母乳免疫球蛋白和摄取抗原对其健康极其重要。

2 肠道屏障功能的评估方法

2.1 尤斯灌流室法

尤斯灌流室法(Ussing chamber)是体外评估肠道屏障功能的常用方法。通过微电极检测细胞膜离子通道变化的电流信号，来反映肠道养分、药物吸收、通透性和分泌情况的变化。采用尤斯灌流室法主要可以测得三项电生理参数：①肠黏膜的跨上皮细胞电阻（TEER），反映上皮细胞间紧密连接的开放程度，即肠黏膜旁细胞途径的通透性[13]。TEER增加则代表细胞通透性降低，反之则提高。②跨膜电导，为TEER倒数[13]。③短直路电流(Isc)，衡量通过黏膜正离子数量的参数。

2.2 分子探针检测方法

医学研究中通过体内渗透试验来评估肠道通透性已有数十年[14]。口服机体无法代谢的物质（探针），经肠上皮细胞吸收后，通过收集尿液或血液检测肠道通透性。最常用的探针是一些特殊的单糖或双糖如D-木糖[8，15-19]。它们不能被消化酶降解，难以在体内代谢，仅能由结肠中的细菌发酵[20]，而且糖几乎只由小肠吸收，对消化和代谢的影响最小。因此，它们可作为测定小肠通透性、特异性的标志物[20]。

分子探针检测方法可不处死仔猪就能测定肠屏障功能，对同一仔猪可重复测量，也可以测定不同健康状态下小肠的屏障功能。这相对尤斯灌流室法有明显的优势。但尤斯灌流室法可以对肠道特定部位的渗透率进行评估，因此这两种方法具有互补性。

一些学者用尤斯灌流室法对仔猪的肠屏障功能进行了监测和评估。用甘露醇和TEER评估旁细胞途径的屏障功能，用辣根过氧化物酶(HRP)评估有关跨细胞途径的屏障功能。甘露醇的分子质量为182 Da，它主要通过旁细胞途径透过黏膜层[20-21]，但也不能排除跨细胞途径。HRP是分子质量为40 kDa蛋白质，具有酶的活性，因此，极低浓度的HRP也能够被检测出来，它在小肠跨膜运输中是一种非常灵敏的检测物质。HRP主要是通过胞吞作用[22-23]透过肠黏膜上皮细胞。黏膜屏障功能受损时细胞胞吞作用加强，其吸收作用增加[23]，同时HRP也可透过通透性的增加紧密连接进入机体[22]。

3 断奶对细胞途径的影响

3.1 对跨细胞途径的影响

Boudry和Verdonk发现，与断奶前相比，在断奶后第2、5、15 d[24]以及第4、7 d[25]空肠前段HRP通透性下降。这可能是由于断奶加快了小肠自然成熟的过程，降低胞吞和大分子物质通过的速率。小肠成熟可以防止动物吸收过多抗原物质，而抗原吸收过多会引起仔猪免疫系统过度激活，进而影响仔猪健康。断奶后肠道会经历一次成熟过程，肠道成熟的实质是成熟的肠细胞替代原有细胞，这一过程涉及到细胞的增殖、凋亡和坏死。Zhu等研究发现，21日龄断奶仔猪肠细胞凋亡显著增加，内源性和外源性的凋亡途径同时被激活，断奶加速了小肠的成熟过程[26]。有研究表明，仔猪断奶后35 d时HRP通透性相对于断奶后15 d时下降了90%[24]，也支持了以上推论。van der Meulen等研究发现，与断奶后1 d相比，空肠中段的HRP通透性在断奶4 d和7 d后增加[27]。但此研究并没有测定断奶前HRP的通透性（第1次测量为断奶后1 d），试验仔猪被运输、隔离，禁食过夜后才进行尤斯灌流室测定。因此，试验前处理造成了应激，使得其结果与Boudry等和Verdonk等的结果相矛盾[24-25]。已有研究证明，应激能增加大鼠小肠HRP通透性[28]。因此，van der Meulen等的试验中HRP通透性的增加是由除了断奶应激之外的试验应激引起的[27]。与空肠不同，回肠中HRP通透性不受断奶的影响[24]。其可能原因是回肠HRP通透性相对较低（仅为空肠的35%），断奶时，回肠中抗原吸收量已处在较低的水平，进一步减少摄入量并无益处。

试验发现，断奶后空肠前段HRP通透性不受营养水平的影响[25]，而空肠中段，其通透性也不受断奶日龄(4周或7周)及营养水平的影响[25，27]。将25 kg仔猪(断奶后4～6周)的基础日粮从代乳粉转变为大麦或小麦日粮，4 d后，仔猪空肠前段HRP通透性与饲喂代乳粉组相比无差异[29]。同时，25日龄断奶仔猪断奶后日粮中添加色氨酸(5 g/kg)，在断奶后4、5、6 d后小肠中段的HRP通透性没有变化[30]，产毒性大肠杆菌感染对3周龄仔猪空肠前段HRP通透性没有影响[31]。Boudry等报道，肥大细胞脱颗粒（应激来源之一，提高通透性）对哺乳仔猪回肠HRP通透性的影响随年龄增大而下降[32]。与此同时，Rådberg等发现，2周龄的哺乳仔猪饲喂红芸豆凝集素会降低小肠对大分子（牛血清白蛋白，45 kDa；卵清蛋白，67 kDa）的通透性[33]。由上可知，常规日粮不影响断奶后HRP通透性，但特定的营养物质可以减少小肠对大分子的通透性，断奶前抗原的摄取水平高于断奶后。这进一步支持断奶后抗原的摄取随着时间的推移而降低是受小肠成熟过程影响的假设。

3.2 对旁细胞途径的影响

Moeser等研究表明，与未断奶组仔猪相比，28日龄断奶仔猪断奶后1 d，空肠中段甘露醇通透性和TEER无差异[34]；而Hu等发现，21日龄断奶仔猪断奶后第3、7、14 d，与断奶时相比空肠黏膜紧密连接蛋白 mRNA 表达降低[35]；Moeser[34，36]和 Boudry等[24]研究表明，3周龄断奶仔猪断奶后第1 d和第2 d，与正在断奶或未断奶的对照组相比，空肠前段和中段甘露醇通透性明显增加，TEER显著减小，表明高龄断奶可以有效防止断奶后的上皮旁细胞运输屏障功能的损伤。此外，Moeser等发现，对于3周龄仔猪，当促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂或肥大细胞稳定剂阻断应激通路后，TEER和甘露醇通透性则不受断奶影响[34，36]，说明应激是仔猪断奶后肠道屏障功能紊乱的主要因素，免疫系统激活肥大细胞对仔猪断奶后肠道屏障功能的损伤有重要影响。但也有一些研究发现，26日龄断奶仔猪肠屏障功能也会受损[25,37-39]。

Verdonk测定以代乳品为日粮的断奶仔猪空肠中段甘露醇通透性，发现高采食量仔猪断奶后1、2、4 d时甘露醇通透性与断奶前无差异，而低采食量仔猪甘露醇通透性在断奶后2、4 d时较断奶前增加。通过比较断奶后1、2、4 d的平均结果发现，低采食量仔猪较高采食量仔猪甘露醇通透性更高[39]。同时，23日龄仔猪禁食2 d后会降低TEER[40]。因此，断奶后充足的采食能有效防止紧密连接屏障功能损伤，表明充足的肠腔营养供应对维持屏障功能的重要性。充足的采食量对小肠前段更加重要，小肠前段较末段更依赖肠腔营养[41]。仔猪断奶后低采食量个体小肠前段绒毛高度降低，高采食量仔猪则几乎无影响[39]，说明高采食量仔猪肠腔营养供应更充分。Spreeuwenberg等[38]也发现，断奶后小肠中段甘露醇通透性增加。Verdonk等[25，39]在另外两个研究中测定断奶仔猪空肠前段上皮细胞甘露醇通透性。第一个试验中，断奶第2 d和第6 d甘露醇通透性较断奶前升高。然而，第二个试验发现，断奶后第4 d和第7 d甘露醇通透性与断奶前相比无差别，且不受断奶后采食量水平的影响。Verdonk后一个试验与其前两项研究[25，39]和 Spreeuwenberg等的研究相比[38]，尽管断奶后饲料摄入量很低，但小肠对甘露醇的通透性并没有增加，可能与试验仔猪的前处理不同有关。在Verdonk的前两项和Spreeuwenberg等的研究中[38]，试验前仔猪经历了运输过程。而Verdonk的最后试验中[39]，仔猪是在同一个地方进行断奶和试验，因而减少了应激。由于应激对肠屏障功能损伤有重要影响，这或许是造成研究结果不同的原因。Lodemann等发现，断奶后7 d仔猪空肠中段甘露醇通透性显著低于断奶前，而TEER与断奶前相比则无差异[42-43]，可能由于测定时间较迟造成的；同时，此试验断奶应激水平可能低于其他试验。回肠TEER在断奶后第5 d和第15 d比断奶前显著增加[24]。Carlson等通过对4周龄断奶仔猪回肠研究也得到类似结论。他们发现，跨膜电导率（TEER倒数）在断奶后1～2 d与断奶前无差异，而断奶后5～6 d和14～15 d则低于断奶前[44]。因此，相较于空肠前段和中段，回肠屏障功能不受断奶过程影响。Berkeveld等[19]分别在断奶前、断奶后0.5、2、4、7 d饲喂仔猪一定剂量的甘露醇，并在1 h后测定血浆中甘露醇浓度，发现血浆中甘露醇浓度随断奶时间逐渐降低，断奶前和断奶4 d时的浓度显著不同。Berkeveld等的研究[19]反映了甘露醇在整个小肠的通透性，而血浆中甘露醇浓度易受多种因素影响，如胃排空率、肠道吸收率和血液的清除率[45]。Berkeveld等[19]的试验结果（饲喂甘露醇）与其它研究结果（尤斯灌流室法）相矛盾的原因可能与检测肠道甘露醇通透性的技术不同有关。

通常，通过饲料预防仔猪断奶后肠道旁细胞屏障损伤的效果较小。在母猪和仔猪日粮补充不同的益生菌对仔猪断奶后空肠中段甘露醇通透性和TEER没有影响[42-43]。在Carlson等的研究中，断奶后5～7 d后铜和锌水平对空肠和回肠的跨膜电导率无影响[44，46]。然而，在 Zhang等的研究中发现[47]，断奶后饲喂2周高浓度锌日粮会使尿液中乳果糖∶甘露醇比值下降。Carlson等与Zhang等的研究差异可能由研究过程中应激水平的不同造成。在Zhang等的研究中，参试仔猪在试验之前被隔离单独饲养并禁食过夜，增加了应激水平。将25 kg仔猪的日粮由代乳品转换为以大麦或小麦为基础的日粮，4 d后空肠TEER与代乳品饲喂组相比无差异，而增加日粮中乳糖浓度（41%∶24%）和减少日粮中的蛋白质浓度（15%∶30%）则会引起小肠中段甘露醇通透性下降[38]。但试验并不能确定乳糖或蛋白质单独对甘露醇通透性的影响。在同一研究中，降低日粮中乳糖浓度(8%∶24%)和增加日粮中蛋白质浓度(45%∶30%)对甘露醇通透性没有影响。Hamard等发现，7日龄断奶仔猪饲喂两周苏氨酸缺乏日粮后，回肠对异硫氰酸荧光素右旋糖酐(4 kDa)通透性增加，TEER也呈下降趋势[48]；Zhu等研究发现，仔猪日粮添加精氨酸可有效阻止脂多糖应激导致的肠道损伤，促进肠黏膜损伤的修复[49]。上述研究表明，常规日粮组成对旁细胞屏障无重大影响，而当日粮中缺乏特定的营养物质（如苏氨酸）时旁细胞屏障会损伤。同时，低采食量也会使肠屏障功能受损。此外，当试验过程伴有其它应激时（如禁食和单独饲养）旁细胞屏障也会受到影响。

小肠屏障功能受断奶过程的影响，断奶日龄、断奶应激、采食量和日粮组成等因素对断奶仔猪肠道屏障功能产生重大影响。断奶过程对仔猪空肠前段和中段肠道屏障功能影响较强，而对回肠影响较弱。断奶应激激活免疫系统和肥大细胞，这对小肠紧密连接屏障功能损伤有重要影响。低采食量是断奶后屏障功能损失的又一重要因素，充足的采食量可以防止旁细胞屏障功能损伤及绒毛高度降低。由于肠道养分供应对前段小肠最为关键，与空肠前段和后段不同，断奶后回肠的旁细胞屏障功能并没有减弱，说明断奶后由采食不足引起的屏障功能损伤是由于肠腔营养供应不足造成的。也有试验证明，仔猪饲喂2周苏氨酸缺乏日粮会引起小肠屏障功能受损。这种由养分供应导致的屏障功能损伤，可能间接由小肠结构损伤引起。旁细胞屏障功能损伤一般只出现在断奶第1周内，2周后就恢复到断奶前水平。高日龄断奶可以防止肠屏障功能损伤[34,50]，这可能由于早期断奶仔猪肠道处于发育早期，肠道功能尚未完善。此外，跨细胞屏障功能在断奶后加强，大分子通过胞吞作用进入体内减少，说明小肠成熟过程可以防止仔猪抗原摄入过量，而断奶仔猪在新环境下，抗原摄入过量可能会导致免疫系统过度激活。

由上可知，3种方法可以预防断奶仔猪肠屏障功能损伤：第一，改善饲料适口性，增加采食量，这种方法已取得一定成效；第二，确定关键的营养物质（如蛋白质或特定氨基酸），对低采食量仔猪以高浓度添加到饲料或饮水中以防止肠道屏障功能损伤；第三，添加特定生物活性成分以调节应激反应和免疫反应。