硬骨鱼类Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白家族研究与应用现状

■徐中玉 范兆廷 陈伟兴 田 壮 段可馨

(东北农业大学动物科学技术学院水产养殖系，黑龙江哈尔滨 150030)

近年来，水产养殖过程中磷的过量投入已经对水体造成了一定程度的污染。近期研究表明，鱼类能够吸收和保留日粮中磷的40%，剩下的60%污染了环境[1]。在日本，水产行业每年大约要消耗50万吨的饲料[2]，而这些仅占世界的1.7%[3]，一般饲料中的磷含量为15～20 g/kg，鱼日粮磷需求依赖饲喂密度、鱼类的养殖条件、鱼体大小以及生命阶段等[4]。由于以上诸多因素的影响，通过减少饲料中磷的添加量这种现状虽然能够得到改善，然而也可能导致了鱼类的磷缺乏症。为了避免上述情况发生，及早诊断出鱼类磷缺乏症对于避免长期磷缺乏症很重要，故需要一个灵敏的诊断标记，使得鱼类缺乏磷的状态在初期就可以被迅速而又准确的得以检测，进而饲料中的磷含量能够得到精准的定位。早期，已有学者对斑马鱼做出研究，表明肠道中的无机磷转运蛋白（Na/Pi）对早期的磷缺乏症能做出快速反应。近年来，对于其他鱼类该转运蛋白的研究也日趋完善起来。该蛋白的深入研究对于改善人工饲养条件下的水体环境和鱼类饲料的利用效率有积极意义。

1 Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白家族

1.1 Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白家族的组成

Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白基因家族代表了一组异源基因，故其分类的标准依赖于结构、功能和进化。在人类中，Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白基因家族有51个家族成员，推断至少能编码378个功能蛋白，并且已从哺乳动物中分离出了3种类型，分别编码3种钠磷协同转运蛋白，即Ⅰ型（Na/Pi-Ⅰ）、Ⅱ型（Na/Pi-Ⅱ）和Ⅲ型（Na/Pi-Ⅲ）。

1.2 Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白

1.2.1 Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白的组成

Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白包括肾脏甲状旁腺素敏感型钠磷协同转运蛋白Ⅱa型和小肠顶端膜钠磷协同转运蛋白Ⅱb型以及Ⅱc型3种类型[5-6]。Na/Pi-Ⅱa型和Na/Pi-Ⅱc型主要存在于肾脏中，Na/Pi-Ⅱb型主要存在于小肠中[7]。Na/Pi-Ⅱa与Na/Pi-Ⅱb在成骨细胞中表达，并以某种方式受无机磷调控，两者具有明显的拓扑学结构相似性，但同功体Na/Pi-Ⅱa和Na/Pi-Ⅱb在3个亲水区上表现出了明显的差异性[8]，且Na/Pi-Ⅱb协同转运蛋白的活性随溶液的pH值增高而增高[9]。

1.2.2 Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白的调控机制

调控Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白对磷进行转运的因素有VD3[10]、低磷日粮[11]、钙磷含量及钙磷比[12]、肠道pH值[13]、钠离子浓度[14]、胰岛素和胰岛素样生长因子[15]、表皮生长因子（FGF）[16]、成纤维细胞生长因子23（FGF23）[17]、甲状腺素[18]、降钙素[19]和甲状旁腺素[20]等。

VD3的调控机理分两类观点，即基因学说与非基因学说[10]。非基因学说认为VD3可能是通过促进小肠黏膜上皮细胞对磷进行转运从而提高吸收的效率，也可能是通过改变膜组成的变化、提高膜的流动性或者与其他因子(如FGF23)发生作用等来提高吸收的效率。基因学说的观点认为，VD3可能调节了动物肠道内Na/Pi与载体蛋白的结合位点数量。研究表明，VD受体缺陷型动物肠道Na/Pi mRNA的表达量受到影响，但mRNA转录水平无影响[21]。1，25（OH）2D-VDR（维生素受体）轴受损，则Na/Pi-Ⅱa表达量显著降低，Na/Pi-Ⅱb表达量无差别[21]。

低磷日粮可以增加肠道刷状缘膜顶端(BBMV)中Na/Pi-Ⅱb转运载体蛋白数量，从而使Na/Pi转运效率提高[11]，但Na/Pi-Ⅱb基因转录水平不随日粮磷水平的变化而发生变化。钙离子与磷酸根离子可形成不溶性的磷酸盐，降低了磷酸盐的溶解性，因而磷酸盐中钙含量升高则磷的相对生物学利用率降低。一般认为，钙磷比率高于2∶1，则磷在动物消化道中的吸收率降低。

不同种类动物消化道的pH值对肠道磷转运速度的影响存在差别[13]。不同pH值通过改变钠离子与磷转运载体蛋白结合的亲和力，从而影响刷状缘细胞膜顶端对磷的吸收。动物小肠刷状缘膜介质中pH值一定时，提高Na+浓度可增加转运系统中转运载体蛋白对磷的表观亲和力，加快Na+依赖型无机磷转运速度，提高无机磷的转运效率。胰岛素样生长因子-I是通过激活近端小管钠磷协同转运蛋白来实现其功能的[15]。FGF参与Na/Pi转运载体蛋白基因的转录过程，是通过调节Na/Pi-Ⅱa mRNA的表达量来抑制磷的重吸收[16]。这可能是因为FGF激活了蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导的途径，负鼠细胞中FGF23含量的升高可导致Ⅱa型钠磷转运蛋白表达量增加。FGF23能导致血清磷含量减少，肾脏磷重吸收减少，肾脏中Na/Pi-Ⅱa和Na/Pi-Ⅱb mRNA的表达量降低[17]。

2 硬骨鱼类Na/Pi转运载体蛋白的研究与应用

目前，硬骨鱼类Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白基因家族已有50个基因被研究报道，推断至少编码338个功能蛋白[22]。

2.1 硬骨鱼类Na/Pi转运载体蛋白研究现状

在高等脊椎动物中，通过多种异源表达系统对Na/Pi-Ⅱb蛋白的功能已进行了评估。硬骨鱼类中克隆的Na/Pi-Ⅱb蛋白的功能已被分析。斑马鱼中已发现的338个Na/Pi转运载体蛋白中就有304个载体蛋白被研究，是鱼类中的模式生物。其次是大西洋鲑有52个载体蛋白被研究、虹鳟有22个载体蛋白被研究、红鳍东方鲀有16个载体蛋白被研究、暗纹东方鲀有11个载体蛋白被研究、日本鳗鲡有10个载体蛋白被研究。Na/Pi-Ⅱb基因序列仅有斑马鱼、虹鳟、鲽、鲤、鲨鱼、鳐和棘鱼被研究报道出来。到目前为止，已经分离出了23种鱼的小肠Na/Pi-Ⅱb基因序列。

2.2 硬骨鱼类Na/Pi转运载体蛋白的组织分布特点

哺乳动物中，通过抗体荧光染色技术发现Na/Pi-Ⅱb蛋白存在于肠道细胞的刷状缘膜、肺泡顶端的细胞以及泌乳细胞的顶膜之中。在鱼类中，Na/Pi-Ⅱb蛋白的作用部位存在个体差异性，如最新分离出来的触须白鱼和苍白鲦鱼的小肠Na/Pi载体蛋白基因与斑马鱼的小肠Na/Pi-Ⅱb1基因同源性高达83%，但与斑马鱼肾脏中的Na/Pi-Ⅱb2基因的同源性只有64%。相对来说，鲤、鲫、鮍、琵琶鲤和长吻似鮈小肠Na/Pi基因和斑马鱼肾脏中的Na/Pi-Ⅱb2基因同源性可高达85%，明显高于小肠中的Na/Pi-Ⅱb1基因的同源性[23]。

研究表明，软体动物的基因序列由于被不同结构域隔开而无法与这些鱼类进行比较，因为这些鱼类使用的PCR引物无法扩增软体动物的基因。尽管在多种条件下重复PCR实验和组织重采样，甲壳纲动物的Na/Pi基因仍然没有被成功的分离出来。目前推测甲壳纲动物Na/Pi基因序列可能不同于脊椎动物和软体动物。

2.3 硬骨鱼类Na/Pi转运载体蛋白的组织表达

哺乳动物Na/Pi-Ⅱb mRNA在小肠、肺、乳腺、睾丸和肝脏等许多组织中表达。存在于小肠和盲肠的Na/Pi mRNA对于初期磷的缺乏最为敏感。鱼类中，Na/Pi基因的mRNA在组织中的分布同样较为广泛，在罗非鱼中Na/Pi基因的mRNA存在于肠道、血液、脾脏和体表（鱼鳞），且肠道中Na/Pi基因的mRNA含量在近端小肠较高，但是在远端肠较低甚至没有。在鲫中，Na/Pi基因的mRNA存在的部位更为广泛，包括肠道、脾脏和体表（鱼鳞）、直肠、肝脏、肾脏、鳃、膘、心脏、脾脏和骨骼肌中，肠道中Na/Pi基因的mRNA含量的分布与罗非鱼一致，近端小肠相对表达量大约70%左右，其含量已经远高于性腺中。在鲫鱼的血液中没有Na/Pi mRNA，但罗非鱼血液中存在Na/Pi mRNA，在鳃、肾脏和脾脏这些含有大量血细胞的组织中表达，所以，经推测Na/Pi mRNA可能存在于鱼类血液中，而不是这些组织中[24]。早期，通过Westernblotting技术已经研究了虹鳟Na/Pi基因的组织分布[25]。近年来，运用RT-PCR技术对其组织分布情况进行了再次检测，证实了从肠道中分离出来的Na/Pi mRNA序列可以在多种组织中表达。

肠道中Na/Pi mRNA在鱼的皮肤（鳞片）中表达，虽然与肠道表达水平相比表达量甚微，但从皮肤中提取的Na/Pi蛋白表明鱼类可能通过体表吸收磷[24]。Na/Pi mRNA也在鳃中表达。这些研究结果都表明，鱼类可能有过滤和消除溶解在水中的磷的能力。早期，Na/Pi协同转运的相关蛋白存在于鳃中就有报道，但其是进行磷的吸收还是排泄尚未确定。近年来还有研究报道，被检测的斑马鱼组织中有大量砷酸盐集聚的位置都有Na/Pi-Ⅱb1的表达[26]，特别是肠道、肾脏和眼睛这些组织，表明该蛋白是负责砷在体内积累的运输蛋白。

2.4 硬骨鱼类Na/Pi-Ⅱ型转运载体蛋白三个亚型的研究现状

目前的研究表明，斑马鱼、鳉、鳟鱼和棘鱼，有多条Na/Pi基因序列，在鲫鱼肠道中只有一条Na/Pi基因序列被分离出来。在斑马鱼[27-28]上的研究表明，这些Na/Pi转运蛋白亚型有多种不同的组织分布模式、不同的表达模式和不同的功能。此外，不同Na/Pi亚型可以以不同的方式对日粮磷含量的限制进行调节。

在鲑鱼，Na/Pi-Ⅱ型基因家族的三个亚型的组织分布模式都是相对独立的。中肠Na/Pi亚型的相对表达量可达到100%，在幽门盲肠，末端小肠和直肠中相对表达量为中肠的13%～46%，在十二指肠的相对表达量为4.09%，仅次于幽门括约肌中。另外，在肝脏中也检测出微量，其他的组织中未有检出。幽门盲肠Na/Pi亚型在幽门盲肠中的相对表达量为100%，但是该亚型也在十二指肠和中肠中被检测出。盲肠Na/Pi亚型基因转录产物在性腺中检测出相对表达量为0.68%，肝脏中相对表达量为0.24%，但未在胃肠道的其他区域和其他组织中检出。肾脏Na/Pi亚型基因的转录产物只特异性的存在于肾脏，在其他组织中未被检测出。

在虹鳟的血液中没有检测到Na/Pi-Ⅱ型蛋白家族的三个亚型。罗非鱼的血液中Na/Pi蛋白的作用有待研究。在斑马鱼中，Na/Pi转运载体蛋白有两个亚型在肠道上皮细胞中表达，分别为有不同功能属性的Na/Pi-Ⅱb1(肠道亚型)和Na/Pi-Ⅱb2（肾脏亚型）。同时，研究Na/Pi基因的组织分布对于除肠道等组织以外的，如鳃和血液等可能对日粮磷限制最为敏感的组织有重要意义。

目前软体动物只有两条Na/Pi转运蛋白基因相关序列（EST）被研究。尽管进行了多次重复实验，甲壳动物Na/Pi转运蛋白基因序列的分离提取仍然不成功，表明甲壳动物的Na/Pi转运蛋白基因序列可能与其他物种不同。但有几种甲壳动物是重要的水产养殖品种，所以在这一领域有研究价值。

2.5 日粮磷水平对硬骨鱼类Na/Pi转运蛋白表达量的影响

在虹鳟中Na/Pi-I（肠道亚型）和Na/Pi-PC（幽门盲肠亚型）蛋白的组织分布是唯一的，表达量都受到日粮磷水平限制的影响。但是相比较而言，肠道亚型的表达量更依赖于日粮磷水平[29]。

早期对虹鳟一系列的研究表明，长期限制日粮磷增加肠道Na/Pi mRNA的表达[25，28，30-31]，但限制日粮磷对其他鱼类Na/Pi mRNA表达的影响研究很少。近年来，对罗非鱼的研究表明，日粮磷的限制（低磷饲养）并未增加肠道Na/Pi mRNA的表达量，骨磷的含量在低磷饲养和高磷饲养的情况下没有明显区别，低磷组的鱼并非磷缺乏症，因此，低磷组和高磷组Na/Pi mRNA的表达水平正常。罗非鱼在饲喂低磷日粮条件下没有出现磷缺乏症，其机理尚不清楚。并且由于罗非鱼是浮游生物摄食者，故其不仅摄食测试的日粮也摄食水域中的有机质和微生物，其同样可以提供一些磷来满足摄食需求，并且鱼类可能有能力通过鳃或者体表或鳞片吸收水体中的磷。

在鲫中，短期低磷饲养而不是长期低磷饲养的鱼Na/Pi mRNA的表达量增加。低磷组鱼骨磷含量明显低于高磷组鱼，表明低磷组鱼磷缺乏。因此，短期低磷饲养条件下Na/Pi表达量的增加是合理的。但长期低磷饲养组并没有明显变化，仍需进一步研究。

3 小结

在哺乳动物中，Na/Pi转运蛋白基因家族编码的三种钠磷协同转运蛋白的研究已经有较大的突破，尤其是Na/Pi-Ⅱ型家族的Na/Pi-Ⅱb蛋白的在动物营养中的研究与应用取得了较好的结果。而在硬骨鱼类中只有斑马鱼，虹鳟、鲽、鲤、鲨、鳐、棘鱼和罗非鱼等23种鱼类的钠磷协同转运蛋白的基因得以分离，在鲫的肠道中只有一条Na/Pi基因序列被分离出来，其他鱼类，包括斑马鱼、鳉、鳟鱼和棘鱼，有多条Na/Pi基因序列被分离。斑马鱼[27-28]的研究表明，Na/Pi-Ⅱ型家族的三个亚型有多种不同的组织分布模式、不同的表达模式和不同的功能。此外，不同亚型可以以不同的方式对日粮磷含量的限制进行调节。对于摄食浮游生物的鱼类，如罗非鱼，不仅摄食日粮也摄食水域中的有机质和微生物（同样可以提供一些磷来满足摄食需求），故研究Na/Pi基因的组织分布对于那些对日粮磷限制最敏感组织，如鳃和血液很重要。短期低磷饲养条件下Na/Pi表达量的上调是合理的。但在长期低磷饲养组没有明显变化，仍需进一步研究。故在未来研究中，分离Na/Pi-Ⅱ型家族的3个亚型和分析日粮磷水平对其影响是研究的重点。