脐血间充质干细胞对一氧化碳中毒迟发型脑病治疗的研究进展

芦 倩 宫殿荣

(1.泰山医学院，山东泰安 271016;2.泰山医学院附属聊城医院神经内科，山东聊城 252000)

间充质干细胞(mesenechymal steme cell，MSC)是来源于中胚层发育的早期细胞，具有全能干细胞的特点，能够多向分化，在适合的条件下可分化为多种细胞，尤其可诱导分化为神经样细胞，表达神经干细胞特异性抗原标志nestin及神经细胞和胶质细胞的特异性抗原标志，甚至出现神经细胞样电活动［2］。脐血作为MSC的来源之一具有含量较丰富，易于采集与保存，且不存在伦理问题，与骨髓相比，MSCs具有来源充足免疫原性更弱等优点，预示脐血比骨髓间质干细胞有更广阔的应用前景。应用脐血间充质干细胞治疗一氧化碳中毒迟发型脑病(DEACMP)较传统方法有很多优点，如低毒性或无毒性，长期有效;下面就脐血间充质干细胞移植治疗DEACMP研究进展进行综述。

1 MSC的起源及定义

1976年，在骨髓培养过程中，Friedenstein等首次发现了一种呈梭形并有突起的贴壁细胞，可分化为类似骨或软骨的集落，随后发现，此类细胞有多向分化的潜能，在特定条件下甚至可以定向诱导分化为神经元及胶质细胞，这种骨髓起源的间质干细胞命名为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenechymal steme cell，BMMsC)。后来，研究者又在胎肺、胎肾、外周血、脐带等多个部位分离出这种具有贴壁能力、梭形、能够多次传代、多向分化潜能的干细胞，与BMMSC具有相似的生物学特性，也属于MSC。

2 脐血间充质干细胞

2000年，Erices 8首先报道了从脐血中分离出成纤维细胞样细胞，能够表达细胞表面抗原SHZ、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29 和 CD49e，与骨髓来源MSC相同，他认为这种细胞也属于间充质干细胞。其后，陆续有研究小组报道从脐血单个核细胞中分离出贴壁细胞，这些细胞表达粘附分子CD13+、CD29+及CD44+，但不表达造血干细胞特异性抗原，其细胞形态、生长方式、生物学特性与骨髓来源MSC相似。研究同时发现，脐血的多能干细胞建系需时较长，前体细胞出现频率明显较骨髓低，骨性抗原表达水平低，无持续表达的神经抗原。提示该类前体细胞可能比骨髓MSC更原始。近年来的研究还发现，在一定条件下，脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)在神经细胞诱导介质中经7～10 d的诱导，呈现神经细胞样形态，可表达神经细胞的特异性表型，提示可用作神经前体细胞的替代来源［3］。可见，脐血间充质干细胞有更多生物学特性和功能有待我们去研究。而且，脐带血存在于胎儿娩出、脐带结扎并离断后废弃的胎盘和脐带中，因此来源广泛，不受伦理学等约束;另外，脐带血干细胞具有人类白细胞抗原配型相合程度要求低、传染病毒风险低、移植后严重排斥发生率较低等特性，这些都预示着脐血间充质干细胞将具有重要的临床实用价值。

3 神经干细胞

Mckay于1997年正式提出了神经干细胞的概念:神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞。1992年首次从成年小鼠脑纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖，且具有多种分化潜能的细胞群。随后的很多实验发现侧脑室壁的脑室下层(subven-tricular zone，SVZ)、海马齿状回颗粒下层(subgranular proliferative zone，SGZ)、室管膜区、大脑皮质、嗅球、纹状体、间脑、小脑、脊髓和视网膜均分离到神经干细胞。神经干细胞具有以下特性:① 可生成神经组织或来源于神经系统;②在一定条件下能不断进行有丝分裂，以满足神经多样性的需要;③多潜能分化，同时又能自我更新;④低免疫原性，神经细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟细胞抗原，较少发生异体排异反应，有利于其存活。

4 脐血间充质干细胞治疗一氧化碳中毒迟发型脑病

4.1 DEACMP目前研究进展

DEACMP是指急性一氧化碳中毒昏迷后，经过一段时间清醒(3～30 d)，再次出现意识障碍、精神症状、震颤等系列症状，主要表现为痴呆、定向力下降、行为异常、震颤、偏瘫、头疼、失眠、乏力、记忆力减退、大小便失禁等［4］。病理改变主要为大脑白质的广泛髓鞘脱失，苍白球出现对称性软化灶。目前DEACMP的发病机制尚未完全明确，近年来，人们一直进行各种探索，如缺血缺氧机制，细胞毒性损伤机制，再灌注损伤和自由基机制，兴奋性氨基酸机制，免疫功能异常和神经递质紊乱机制，神经凋亡机制等。目前临床主要以改善脑循环、营养神经细胞，结合高压氧及对症治疗为主，然而使用神经节苷脂、依达拉奉和多奈哌齐等药物对DEACMP患者的预后无明显影响［5］，高压氧治疗也仅能缩短CO的半排出期，促进排除CO，增加血液中的氧含量，改善组织修复环境，只在CO中毒急性期作用显著，对DEACMP治疗只起辅助作用［6］。近年来，不少研究表明，CO中毒后期持续使用HBO治疗CO中毒，以及使用HBO治疗迟发性脑病，理论依据均不足［7］，更有研究指出长期HBO能导致氧中毒，加重病情进展。干细胞的出现无疑为DEACMP的治疗开辟了新空间。

4.2 神经干细胞在治疗DEACMP中的作用

研究发现脑损伤时神经干细胞能被激活，发生增殖、迁徙并分化［8］。SVZ的干细胞沿嘴侧迁移路径(rostral migratory stream，RMS)迁移至嗅球，分化发育成新的中间神经元并进一步建立起神经连接;SGZ的干细胞则发育形成另一种不同类型的神经元-颗粒细胞，并与海马齿状回建立突触联系。脑组织损伤、缺血、生长因子等引起了脑内某些因子变化，通过不同途径作用于神经干细胞，诱导内源性NSCs增殖、分化和迁移，增殖分化的神经元部分代替和修复受损的神经元，对损伤产生可塑性反应。而脑损伤后仅调动内源性神经干细胞自我修复是有限的，不仅神经干细胞的数量不足，而且某些调节迁移、分化、存活、神经元修复和突触形成的因子也不足，导致自体干细胞其修复能力有限。然而临床中枢神经系统疾患病例中，原位神经干细胞在中枢神经系统疾病发生过程中，并未发挥自我修复作用。其可能原因有:①原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用。②患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。因此神经干细胞的发现和体外培养成功及移植治疗，为中枢神经系统病的细胞替代疗法拓宽了道路。虽然如上所述神经系统疾病细胞替代治疗最理想的种子细胞是神经干细胞，但神经干细胞取材困难，特别是胎脑的来源有限，还受到伦理和法律的束缚，限制了其临床的应用。

4.3 脐血间充质干细胞治疗DEACMP的研究

4.3.1 移植途径和方法

UCB-MSCs移植的途径有:通过脑立体定位仪将UCB-MSCs注入侧脑室、纹状体、海马等;直接注射入脑室或蛛网膜下腔，通过脑脊液的流动将细胞带到病变部位;注射入静脉或动脉，使其通过血脑屏障到达病变部位，主要应用于鼠尾静脉注射。UCB-MSCs移植治DEACMP的方法主要有:一是将未诱导或修饰过的UCB-MSCs直接移植入体内，利用体内环境的信号诱导分化为合适的细胞。另外一种方法是移植经过诱导或因修饰过的UCB-MSCs，使其分化为所需要的神经细胞后再移植入体内。

4.3.2 移植的影响因素

UCB-MSCs的选取、分离培养方法，分化为神经细胞的效率，移植细胞的类型、数量、合适的比例、合适的移植位点，UCB-MSCs对细胞外环境的影响以及细胞外环境对UCB-MSCs的影响，脑中内源性因子的作用以及UCB-MSCs在脑内存活时间对移植疗效均有一定的影响。Karen等发现，UCB-MSCs分离较为合适的条件是，样本保存时间不超过15 h，样本中血液体积要超过33 ml，并且血液中没有血凝块和胰酶，单份血液中的 MSC要超过 108。Buzanska等将贴壁后的UCB-MSCs在含EGF培养基中培养6周，获得nestin阳性的细胞集落，随后将这种细胞分别用多聚左旋赖氨酸、视黄酸和BDNF诱导，可分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞;若与大鼠脑原代培养单层细胞共培养，也可获得神经元和神经胶质细胞。

4.3.3 UCB-MSCs治疗DEACMP的可能机制

①UCB-MSCs本身所具有复杂精细的控制系统，可以防止蛋白质的错构和聚集，如分子伴侣促进适当的蛋白质折叠，防止非天然的蛋白质聚集［9］。医疗控制可以使处于错构的蛋白质被泛素蛋白酶小体系统以及吞噬体溶酶体系统降解，尤以泛素蛋白酶小体系统重要，从而阻止疾病病程的进展［10-11］。②UCB-MSCs可以定位包绕在病变组织的周围，并形成网络修复坏损的神经组织，使患者能够恢复丧失的神经功能［12］。③UCB-MSCs在中枢神经系统微环境下能分泌脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子等营养因子，或者刺激损伤部位产生内源性因子，促进损伤组织的修复并减少细胞凋亡。④UCB-MSCs移植入脑后，能形成表达神经标志性蛋白的神经元样细胞或星形胶质细胞，产生的细胞可在受损部位周围存活甚至移行至全脑［13］。⑤UCBMSCs可分化成血管内皮细胞和细胞外基质，帮助神经保护、促进血管发生［14］。⑥UCB-MSCs可以分泌多种神经营养因子以营养激活内源性神经干细胞，并诱导分化成神经组织细胞替代缺损细胞，即启动内源性途径修复损伤。⑦在脑内创造适宜的局部微环境，通过体外扩增或不同因子诱导分化的方法使UCB-MSCs分化为神经细胞后进行移植，替代受损细胞重建神经功能区和传导通路［15］。近年有研究表明，UCB-MSCs可以改善患者的自主神经、小脑锥体外系和运动症状［16-17］。因此，其在DEACMP的临床应用必将得到推广。

5 展望

脐血间充质干细胞因其来源丰富、采集方便、具备自我更新、多向分化的能力，在特定的诱导条件下可向其他组织分化，移植后免疫排斥反应低等特点备受大家关注。目前，临床上已用于治疗脊髓损伤［18］、多系统萎缩［19］、帕金森氏病［20］、脑瘫患儿［21］等神经系统疾病，并取得了显著疗效，为广大患者带来了希望。然而其分离、培养及鉴定还有许多工作要做，脐血间充质干细胞的诱导、分化及迁移机制有待研究，移植的最佳时间窗仍有待于解决，脐血间充质干细胞移植的疗效及安全也需进一步评定，但相信随着科学技术的发展，上述存在的问题将逐步解决，脐血间充质干细胞的应用将有广阔的前景。

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