羊栖菜急性毒性实验及体外抑菌活性的研究

钱媛华，杨靖亚，孙立春，王燕萍，王 珍

（上海海洋大学海洋科学研究院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

羊栖菜[Sargassum fusiforme（Harv.） Setchel]属褐藻门马尾藻科，藻体黄褐色，多分布于我国沿海，素有“长寿菜”、“餐桌上的海人参”之美誉，在中国古代，人们有用海藻羊栖菜入药的习惯，南齐陶弘景的《神农本草经》[1]及李时珍的《本草纲目》[2]均有记载。现代研究也表明羊栖菜具有降血压、降血脂、抑菌、消除放射性物质危害、防癌抗癌和减肥美容等功效[3-5]。羊栖菜水提物的成分比较复杂，但现已基本确定其有效成分主要是羊栖菜多糖（Sargassum FusifomePolysaccharides，SFPs），一种水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖胶和褐藻淀粉的形式存在，具有复杂的多方面的生物活性与功能特点，且为非细胞毒性物质，其中，硫酸根的含量与多糖的生物活性具有密切关系[6-7]。虽然羊栖菜有极高的食用和药用价值，但由于其特殊的砷富集作用（世界卫生组织下属国际癌症研究组织已把砷列为致癌物），使得其全藻中砷含量严重超标，让很多国家和地区对其敬而远之。到目前为止，尚未有对羊栖菜全藻及水提物的可食用性及抑菌活性进行的报道。针对沿海地区人们热衷于食用羊栖菜全藻，以及国内市场上出现的以羊栖菜水提物为主料的保健饮料，本实验定量检测了羊栖菜全组分及水提物中多糖、硫酸根、总砷及无机砷含量，对羊栖菜的急性毒性及体外抑菌活性进行了考察，为探究羊栖菜的食用安全性及开发利用性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊栖菜 购自浙江洞头农业科技发展有限公司；实验动物 昆明种小鼠，雌雄各半，由上海复旦大学提供，合格证号SCXK（沪）2009-0019；变异链球菌 四川大学华西口腔医学院龋病研究室惠赠；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 上海海洋大学食品学院微生物培养室；脑心浸液（BHI）液体/固体培养基 购自北京陆桥技术有限责任公司；营养琼脂培养基（NA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA） 购自上海康润生物科技有限公司；浓盐酸、明胶、氯化钡、硫酸钾、三氯乙酸、苯酚、浓硫酸、葡萄糖等试剂 均为分析纯。

HWS-24双列四孔恒温水浴锅 上海慧泰仪器制造有限公司；JA1003B光电分析天平 上海越平科学仪器有限公司；DHG-9140A烘箱 上海慧泰仪器制造有限公司；TGL-20C冷冻离心机 上海圣科仪器设备有限公司；UV1102PC紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器；DHG-9140A数显电热恒温鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；BPH-9082精密恒温培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜样品制备[8]干羊栖菜预处理→消化→匀浆→羊栖菜全藻组分（每毫升全藻组分含0.1g干羊栖菜，即0.1g/mL）

干羊栖菜预处理→热水浸提→冷却→过滤→离心→浓缩→羊栖菜水提液（每毫升水提液含1g干羊栖菜，即1g/mL）

工艺说明：a.羊栖菜预处理：自来水浸泡过夜，洗净，切小段。b.消化：加入5‰ Na2CO3即纯碱，90℃、消化6h。c.匀浆：组织匀浆机匀浆得全藻组分。d.热水浸提、离心：热水浸提两次，100℃水浴2h，400目滤网过滤，合并滤液，离心得上清，浓缩后即为羊栖菜水提液。

1.2.2 羊栖菜样品中相关成分检测方法

1.2.2.1 苯酚-硫酸法测定多糖浓度[9]绘制标准曲线：配制葡萄糖标准溶液（40μg/mL），分别吸取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以水补至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，静置10min后摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光度。以2.0mL水按同样方法操作，作为空白，以多糖微克数为横坐标，光密度值为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程为y=0.0089x，R2=0.996。

样品多糖含量测定：吸取样品液1.0mL，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算羊栖菜水提液、全藻组分中多糖含量。

1.2.2.2 硫酸基的氯化钡-比浊法测定硫酸根含量[10]

标准曲线的制备：精确吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL标准硫酸基溶液于具塞试管中，标记为0、1、2、3、4、5、6管，各管以lmol/L HCI溶液补加总体积至0.2mL。另加入3.8mL 3%三氯乙酸和lmL氯化钡-明胶溶液，混合，室温静置15min，于分光光度计上测定360nm处测光密度值，以0管作对照得A1。另用同样标准溶液系列，唯以明胶试液代替氯化钡一明胶溶液，于分光光度计上测定360nm处测光密度值，以0管作对照得A2。以硫酸基微克数为横坐标，纵坐标为吸光度（A1-A2），作标准曲线，得回归方程为：y=0.0008x，R2=0.995。

样品含量测定：以lmol/L HCl作溶剂配制适量浓度的样品液，封闭管在100℃加热3h，冷却后吸取0.2mL进行分析，按上法测光密度值，对照标准曲线计算硫酸基含量。

1.2.2.3 总砷及无机砷的测定 根据GB/T 5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》。

1.2.3 羊栖菜样品对小鼠的急性毒性实验 参照经典的急性毒性实验方法，进行羊栖菜全组分、水提液的急性毒性实验[11-13]。

1.2.3.1 预实验 在进行正式实验之前，首先做预实验以便为正式实验提供依据。若死亡率≥30%，则测定半数致死量（LD50）；如不足以引起死亡，则采用最大灌胃量测定。小鼠12只，随机分为3组（全组分组、水提组、对照组），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水12h。给药组给以可供灌胃的最大浓度（全组分0.1g/mL、水提液1g/mL）、小鼠灌胃可承受的最大体积（0.8mL/20g）一次灌胃给药，给药后常规饲养，连续观察7d。对照组给予等量蒸馏水。结果小鼠全部存活，灌胃给药无法测出本品的半数致死量（LD50），提示该药是较安全的。

1.2.3.2 正式实验 根据预实验结果，进行小鼠最大给药量的实验。昆明种鼠60只，随机分为三大组：全组分组、水提组、对照组，每组20只，雌雄各半。日内3次灌胃，以最大给药浓度、最大灌胃体积进行灌胃，连续观察7d，详细记录小鼠的体重、活动、饮食、毛发、大小便及死亡情况。计算出总给药量，并推算出相当于临床用药量的倍数，以耐受成人用量口服100倍以上为安全。计算方法：

小鼠最大给药量（g/kg，系折合生药量计算）=每日小鼠灌胃量（mL/kg）×药物浓度（g/mL）×每克样品的生药量（g/g）；

小鼠最大耐受量倍数=每只小鼠的耐受量（g/kg）/小鼠平均体重（kg）×成人平均体重（g/kg）/成人每天用量（kg）；

小鼠总砷最大给药量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×样品总砷含量（μg/mL）；

小鼠无机砷最大给药量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×样品无机砷含量（μg/mL）。

表1 羊栖菜样品中多糖、硫酸根、总砷及无机砷含量（）Table 1 The contentof polysaccharides，sulfuric radical，total arsenic and inorganic arsenic in Sargassum fusiforme samples（）

样品 多糖（mg/mL） 硫酸根（mg/mL） 总砷含量（μg/mL） 无机砷含量（μg/mL）全组分（0.1g生药量/mL） 11.5 0.534 1.2 1.0水提组分（1g生药量/mL） 14.5 2.9 4.4 3.6

1.2.4 羊栖菜样品的抑菌性实验

1.2.4.1 细菌的培养及菌液制备 将-80℃保存的金黄色葡萄球菌、变异链球菌、大肠杆菌复苏后分别接种于TSA固体培养基、营养琼脂培养基、BHI固体培养基，一定条件下37℃培养24h，涂片镜检后挑单菌落分别接种于TSB液体培养基、TSB液体培养基、BHI液体培养基，一定条件下37℃培养24h，收集菌液，调节菌浓度为1.8×l04CFU/m L。

1.2.4.2 样品对三种细菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定[14]采用液体稀释法测定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），具体方法为：在96孔板中羊栖菜全藻组分从25mg/m L浓度开始进行二倍稀释，序列中水提液最低浓度为0.2mg/m L；羊栖菜水提液从250mg/m L浓度开始进行二倍稀释，序列中水提液最低浓度为2.0mg/m L。每孔样品液和菌液各100μL，37℃培养48h，肉眼观察无细菌生长的样品液最低浓度为MIC。同时设阴性对照和阳性对照，阴性对照组为样品液和液体培养基各100μL，其样品药物浓度对应实验组样品药物浓度；阳性对照组为相应液体培养基和菌液各100μL。每个浓度设4个平行孔。取肉眼观察清亮的实验组孔中的液体，划线接种于相应固体培养基平板，37℃培养48h，无细菌生长的最低药物浓度为最低杀菌浓度（minimal bactericidalconcentration，MBC）。

1.2.5 实验数据统计方法 统计分析：所有的数据用均数或均数±标准差表示，数据采用Independent Samples t Test，统计软件用SPSS 18.0，p＜0.05表示差别有统计学意义，p＜0.01表示差别有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 羊栖菜样品中多糖、硫酸根、总砷及无机砷含量

干羊栖菜全藻的基本成分为：蛋白质12.05%、碳水化合物60.71%、脂肪0.45%、灰分12.47%、水分含量14.32%[15]。羊栖菜水提物的成分比较复杂，但现已基本确定其有效成分主要是羊栖菜多糖。由表1可知，全组分中多糖得率为11.5%，硫酸根占多糖含量的4.6%。水提物多糖得率为1.45%，硫酸根占多糖含量的20%。羊栖菜全组分及水提物中无机砷含量都超过了GB 19643-2005《藻类制品卫生标准》中关于藻类中无机砷（干重计）≦1.5mg/kg的限量标准（这个标准是根据砷的毒性和人体藻类可能摄入量来定的），且无机砷含量均占总砷含量的80%以上。顾晶晶等[16]报道LD50与无机砷呈负相关关系，即无机砷含量越高毒性越大，相比较与总砷含量的相关性较差。

2.2 羊栖菜水提液、全组分对小鼠急性毒性实验结果

2.2.1 一般情况 由表2可以看出，小鼠按最大容量于1d内灌胃给予最大限度的样品后，连续观察7d，所有受试小鼠毛色光洁，饮食、活动和二便正常，鼻、眼、口腔无异常分泌物，未出现不良情况和死亡情况。

2.2.2 体重变化 由表3可以看出，给药组与对照组小鼠体重在给药后7d均增加，但给药组与对照组比较无显著性差异（p＞0.05）。

表3 羊栖菜样品最大给药量实验对小鼠体重的影响（±SD）Table 3 The change ofmice body weightunder the maximum dose of the Sargassum fusiforme samples（±SD）

注：给药组与对照组比较无显著性差异（p＞0.05）。

组别 给药前体重（g）给药后体重（g）体重前后变化（g）全组分组 19.24±1.14 21.54±1.30 2.3±0.62水提组 19.11±1.16 21.75±1.37 2.64±0.73对照组 18.51±0.84 20.63±1.08 2.12±0.38

2.2.3 脏器观察 对三组小鼠进行大体解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠等主要脏器，均未见组织有异常改变。

2.2.4 结果计算 羊栖菜全组分组小鼠最大给药量为12g生药量/kg·BW，表明小鼠对羊栖菜全藻组分组的耐受量至少为12g生药量/kg·BW，相当于成人拟定日食用干羊栖菜量（5g/d）的120倍；折算成小鼠总砷最大给药量144μg/kg，相当于成人每日总砷允许摄入量（WHO：暂定总砷摄入的安全标准为每日50μg/kg·BW）的2.9倍；折算成小鼠无机砷最大给药量120μg/kg，相当于成人每日无机砷允许摄入量（WHO：暂定无机砷摄入的安全标准为每日2.1ug/kg BW）的57.1倍。

羊栖菜水提组小鼠最大给药量为120g生药量/kg BW，表明小鼠对羊栖菜水提液的耐受量至少为120g生药量/kg·BW，相当于50kg成人拟定日食用干羊栖菜量的1200倍；折算成小鼠总砷最大给药量528μg/kg，相当于成人每日总砷允许摄入量的10.6倍；折算成小鼠无机砷最大给药量432μg/kg，相当于成人每日无机砷允许摄入量的206倍。

2.3 羊栖菜样品对三种细菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定结果

实验结果显示，羊栖菜全组分对金黄色葡萄球菌的MIC为125mg/m L，MBC为250mg/m L；羊栖菜水提液对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC均为125mg/m L。羊栖菜全组分及水提液对大肠杆菌、变异链球菌均未观察到抑菌作用。

3 结论与讨论

实验首先证实了羊栖菜全藻样品及水提样品中无机砷含量超标，但在随后进行的羊栖菜全藻样品及水提样品对小鼠的急性毒性实验中，并没有观察到有相应的砷中毒现象发生，理论上可初步判定羊栖菜全藻样品及水提样品毒性较低，可食用性较好。这种现象，一方面原因可能是羊栖菜样品中丰富的多糖除具有吸收脂肪和胆固醇的作用外，对重金属和放射性元素亦具有阻吸作用[17]，或者是羊栖菜本身含有的某些其他成分在体内对砷的毒性有抵抗作用，这就有待于后期的进一步探索。另一方面，关于毒性的概念，不能停留在急性毒性的认识上，毒性与剂量、接触途径、接触期限等都有密切关系，所以评价毒性，不能仅以急性毒性高低来表示，针对有一些有害物质的急性毒性是属于低毒或微毒，但却有蓄积毒性、亚急性、亚慢性毒性、致畸毒性、生殖毒性、致癌性等其他毒性，而这些毒性对人类的健康造成的伤害是巨大的。故关于羊栖菜的食用安全性研究，还应该结合长期毒性实验的毒性表现及多种检测结果综合分析评价其毒性。

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