乳清蛋白-麦芽糖糊精的Ma i l l a r d反应复合物制备β-胡萝卜素纳米乳液

李 燕，刘成梅，刘 伟，钟俊桢

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学中德食品工程中心，江西南昌330047）

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀后存在于乳清中的蛋白质，为全价蛋白，易于消化吸收，具有很高的营养价值。乳清蛋白具有一些突出的功能特性，可作为乳化剂、稳定剂、保湿剂、起泡剂等应用于食品加工中。乳清蛋白的一些特点如易在等电点附近发生聚合和沉淀，限制了其在食品工业中的应用[1－2]。通过Maillard反应与还原糖类共价复合，乳清蛋白的多种性能可得到改善。由于Maillard反应的反应条件温和，且无需添加化学试剂，被视为一种安全、有效的蛋白质改性方法。目前对乳清蛋白与多糖的Maillard反应复合物（Maillard Reaction Products，MRPs）的研究主要集中在提高蛋白质乳化能力[1]、乳化稳定性[3]及热稳定性[4]等功能上。食品工业中乳液在应用时往往需要在油相中溶解一些疏水的活性物质如β－胡萝卜素。对油相中活性物质的保护，在乳液制备中非常重要。相对小分子乳化剂，蛋白乳化剂能够更好地保护乳滴中易降解的物质，而蛋白与多糖的MRPs可在提高乳液物理稳定性的同时进一步提高油相中β－胡萝卜素的化学稳定性[5]。因此，本文拟通过在温和条件下的Maillard反应制备WPI与MD的MRPs，将其用于制备β－胡萝卜素的纳米乳液，并考察纳米乳液的物理稳定性及MRPs对油相中β－胡萝卜素是否存在保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

乳清分离蛋白（Whey Protein Isolate，WPI）蛋白含量85%，上海爱兰比亚营养品有限公司；麦芽糖糊精（Maltodextrin，MD）Sigma－Aldrich，USA，DE值16.5～19.5，平均分子量约1000u；玉米油 购自当地超市；β－胡萝卜素，Fluka，USA，纯度≥97%；其余试剂 为分析纯。

Ultra－Turrax T25 Basic高速乳化分散机 德国Janke&Kunkel KG.IKA－werk公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；NCJJ－0.2/150超高压均质机 廊坊通用机械有限公司；NICOMP 380/ZLS纳米粒度仪 美国PSS公司；CR－10色差仪 日本，柯尼卡美能达公司。

1.2 乳清蛋白乳液的制备

WPI溶解于磷酸盐缓冲液（pH7.0，10mmol/L）中，同时加入0.02%的NaN3，磁力搅拌3h以上，使蛋白充分溶胀，形成水相。一定量的玉米油为油相，在分散机高速剪切2min制备得到粗乳液，然后在高压微射流仪中均质乳化，得到纳米乳液，用于进一步分析。

1.3 WPI-MD MRPs的制备[6]

将WPI（5%）与MD（10%）分别溶解于超纯水中，磁力搅拌过夜，使溶质完全水化。将WPI与MD溶液按照质量比1∶2混合，磁力搅拌3h以上，使蛋白和多糖分子充分接触后冻干。冻干的蛋白多糖混合物置于底部装有饱和KBr溶液（相对湿度79%）的玻璃干燥器中，80℃反应2h，制备得到WPI－MD的MRPs，所得产物置于－18℃冰箱储存。

1.4 WPI-MD MRPs接枝度的测定

参照Habeeb[7]的方法稍作改进。取0.3mL蛋白溶液（浓度1mg/mL），加入2mL PBS缓冲液（50mmol/mL，pH8.2）和1mL TNBS溶液，涡旋振荡混匀，在40℃水浴中避光反应2h，然后取出加入1mL 0.1g/100mL的SDS溶液和1mL 0.1mol/mL HCl终止反应，室温下放置30min，于340nm波长处测定吸光度。按照式（1）计算接枝度。

式中：A0为接枝反应前样品的吸光度；At为反应后样品的吸光度。

1.5 β-胡萝卜素乳液的制备

称取一定量β－胡萝卜素置于玉米油中，避光60℃磁力低速搅拌1h，使其完全溶解，形成油相（β－胡萝卜素浓度为0.05%）；将乳化剂加入pH3.2，50mmol/L柠檬酸盐缓冲液中，同时加入0.02%NaN3用于防腐，磁力搅拌3h以上，使乳化剂完全水化（乳化剂浓度为蛋白当量0.5%）。高速剪切搅拌，同时滴加5%的油相于水相中，9000r/min剪切3min，形成粗乳液。将制备的粗乳液通过高压微射流仪进一步均质得到β－胡萝卜素乳液，将制备乳液迅速避光保存。

制备的β－胡萝卜素乳液用50mmol/L，pH3.0柠檬酸盐缓冲液适当稀释，采用NICOMP 380/ZLS纳米粒度仪室温分析乳液粒径大小（平均粒径）与分布（多分散系数，PDI）。

1.6 β-胡萝卜素含量的测定

β－胡萝卜素标准曲线绘制：准确称取20mg β－胡萝卜素标品，以少量氯仿溶解，加入正己烷定容至100mL为1号母液。取1号母液4mL置于50mL容量瓶中，定容，得到2号母液。分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 2号母液置于容量瓶中，定容至10mL，测450nm处吸光度。

乳液中β－胡萝卜素含量测定[8]：准确称取1g乳液，正己烷+乙醇（3∶2）混合溶剂连续提取3次，合并上相，定容至10mL，以正己烷为参比，测定450nm处吸光度，结果通过标准曲线算出。

2 结果与讨论

2.1 WPI乳化性能的考察

分别考察了WPI乳液制备参数对WPI乳液物理特性的影响，包括WPI浓度、微射流均质压力、均质次数的影响。

按照1.2的方法制备乳清蛋白乳液（油相质量比10%，微射流压力120MPa，5次循环），考察WPI稳定乳液的粒径分布随WPI浓度的变化。如图1所示，当WPI的浓度为0.5%～2.5%时，随着WPI浓度的增加，乳滴平均粒径变小，但变化幅度不大。WPI的浓度大于0.5%时，蛋白浓度的升高对乳滴粒径的减小贡献不大，这一结果与文献报道的结果类似，即当WPI浓度大于0.5%时，乳液中油水界面被WPI饱和，乳液粒径变化与WPI浓度无关[5]。而WPI浓度为0.5%，乳液较易分层，为MRPs对乳液稳定性的提高提供了提升空间，因此本文采用蛋白当量浓度为0.5%进行β－胡萝卜素纳米乳液的制备。随着WPI浓度的升高，乳液的PDI值变化不大，即所得乳液随WPI浓度升高其分布均匀性变化不大，进一步表明乳液油水界面在WPI为0.5%时已基本被蛋白分子饱和。

当WPI浓度0.5%，油相5%，微射流5次循环时，考察微射流均质压力对纳米乳液粒径的影响，结果如图2所示。结果表明固定循环次数为5次，随着微射流均质压力增大，乳滴粒径逐渐减小。当压力大于166MPa时，乳滴的粒径变化不大，但PDI值明显减小。乳状液属于动力学稳定体系，高压均质能够为乳液提供一定的能量输入，使乳液分散体系能够在一定时间内保持稳定。随着输入功率的加大（即均质压力和均质次数的共同影响），乳滴粒径先下降后上升[9]。而本文的结果并未呈现这一趋势，可能是由于在本文的实验条件下，均质过程输入的功率并未达到破坏乳液稳定性的临界值。尽管在高压区乳液有较小的粒径，较窄的粒径分布，考虑到压力过大会加速β-胡萝卜素的降解，应选用低压段制备β-胡萝卜素纳米乳液。当均质压力为60MPa时，乳滴平均粒径为330nm（一般纳米乳液的平均粒径小于500nm），可视为纳米乳液，因此选用60MPa为制备β-胡萝卜素纳米乳液的工作压力。

当WPI浓度0.5%，油相5%，微射流压力60MPa时，考察微射流均质次数对纳米乳液粒径的影响，结果如图3所示，均质次数对乳液平均粒径影响不大，但PDI值波动较大。当均质次数小于三次时，PDI值极不稳定，说明乳液体系未能形成较为稳定的分散系统。当均质次数大于或等于三次时，乳液的PDI值相对较为稳定。同样考虑到过大的输入功率加速敏感物质的降解，选用均质次数为3次，制备β-胡萝卜素纳米乳液。

2.2 WPI-MD的MRPs的制备

将制备得到的WPI-MD MRPs（HWMD）与冻干WPI（WPI）、同样条件下加热的WPI（HWPI）、冻干的WPI与MD的混合物（WMD）相比。冻干WPI呈白色片状疏松结构。加热后的WPI疏松度降低，颜色变化不大。WPI与MD的冻干混合物呈白色粉末，结构比较紧实。而WPI-MD的MRPs结构更为致密，颜色为淡黄褐色，说明发生了Maillard反应。

由于Maillard反应发生于还原糖上的羰基与ε-氨基之间（蛋白质中主要为赖氨酸），所以蛋白质的接枝度可以通过测其游离氨基酸含量进行表征。如表1所示，WPI、HWPI的接枝度未检出（原始WPI与HWPI游离氨基酸含量无显著差异。本文以原始WPI的游离氨基酸含量为参照计算接枝度，因此WPI与HWPI样品的接枝度视为未检出），而MRPs具有高达44.8%的接枝度。此外，结果显示，WPI与MD混合物亦有高达9.1%的接枝度，说明有可能在冻干、混合过程发生了一定程度的Maillard反应。

2.3 β-胡萝卜素乳液的制备与表征

β-胡萝卜素对光及其敏感，热稳定性较好，需要在避光加热条件下使其充分溶解于油中。

2.3.1 β-胡萝卜素乳液的物理稳定性 如图4所示，纳米乳液具有一定的物理稳定性。WPI与HWPI的物理稳定性相差不大。样品制备后立即测定，MD的加入可显著降低乳液的平均粒径（p＜0.05）。仅用WPI为乳化剂时乳滴平均粒径高达410nm，而与MD的混合物乳滴粒径为348nm，经加热复合后，其平均粒径进一步降低为284nm。样品在40℃避光保存40d后，乳液粒径变化不大，说明形成了较为稳定的分散体系。观察样品的外观发现，HWMD稳定的乳液在经过40d室温储藏后，其浊度随试管的上下分布基本一致，而其他三个样品的下层均出现浊度随高度变大的现象（数据未显示）。蛋白质与多糖的MRPs降低乳液粒径的结论多有报道[1，3，10]。一般认为MRPs吸附在油水界面上，连接在蛋白分子上的糖链伸入水相中，使界面膜的厚度增加。同时，包裹与蛋白质膜外层的多糖膜可以增加乳滴靠近的立体位阻，从而提高乳液的物理稳定性[3]。

2.3.2 β-胡萝卜素乳液的化学稳定性 考察纳米乳液中β-胡萝卜素的化学稳定性，结果如图5所示。WPI-MD的MRPs非但没有对包埋其中的β-胡萝卜素起保护作用，反而加速了其降解。40℃避光保存40d后，HWMD稳定的乳液中β-胡萝卜素的含量仅为初始含量的7.1%±1.1%。而加热WPI与WPI-MD的混合物显示出对β-胡萝卜素良好的保护能力，同样储藏条件下，β-胡萝卜素含量分别高达30.1%±1.3%和29.0%±1.3%。Xu等[5]用WPI与甜菜果胶的MRPs制备β-胡萝卜素纳米乳液，发现共价复合物稳定的乳液体系可大幅提高乳液中β-胡萝卜素对光曝、储藏的化学稳定性，同时降低乳液的平均粒径。MRPs中使用的多糖分子链越长，形成的界面膜越厚，对油相中的物质保护作用应该越明显。本文的使用的MD平均分子量为1000u，远小于果胶的分子量，其对β-胡萝卜素的保护作用小于WPI-甜菜果胶是可以预见的。然而，WPI-MD的MRPs对β-胡萝卜素的保护作用尚不如冻干WPI，说明MRPs对油相中的β-胡萝卜素是否存在保护作用可能并非多糖层的厚度决定，其潜在机理有待进一步研究。

3 结论

本文系统考察了乳液制备参数对乳液粒径分布及稳定性的影响，同时制备了WPI-MD的MRPs。以此为基础，制备了WPI-MD MRPs稳定的β-胡萝卜素纳米乳液，并进一步考察了乳液的物理稳定性及β-胡萝卜素的化学稳定性。WPI-MD的MRPs能够显著降低纳米乳液的粒径，并提高纳米乳液的稳定性，但并不能同时提高蛋白乳化剂对油相中β-胡萝卜素的保护作用。相反，WPI-MD的MRPs加速了油相中β-胡萝卜素的降解，其机理有待进一步研究。

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