动态超高压微射流技术在三叶青叶黄酮的提取中的应用

孙 永，李红艳，刘小如，邓泽元

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）

三叶青（Radix Tetrastigmae）为葡萄科植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Dielset Gilg）的块根或全草，为我国特有珍稀植物[1]。分布于我国浙、赣、闽、粤、川、云、黔等省区[2]，可活血止痛、祛风化痰、清热解毒，用于肺炎、高热惊厥、哮喘、咽痛、肝炎、瘰疬、月经不调、风湿等症。三叶青提取物有消炎镇痛、抗病毒等作用，广泛应用于民间治疗病症[3-5]。据报道，三叶青的化学成分主要为黄酮类化合物、还原糖、淀粉、氨基酸、甾类化合物等[6]。而三叶青叶片的的化学成分的报道相对较少，其主要含有黄酮类化合物和花青素类[7]。作为一种新兴的超微细化技术，动态超高压微射流技术能对物料产生强烈剪切、高速撞击、高频振荡、压力瞬间释放等一系列的综合作用，从而导致细胞破碎，与此同时对活性成分几乎没有影响，并且能起到很好的超细化和均一化效果[8]。目前，动态超高压微射流技术被用于灭菌[9]、多糖提取[10]、蛋白质改性[11-12]及淀粉改性[13-14]。运用动态超高压微射流技术来提取黄酮的研究相对较少。本实验采用响应面法优化动态超高压微射流技术提取三叶青叶黄酮的工艺条件，提高三叶青叶黄酮的得率，为全面开发和利用三叶青这一珍稀物种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三叶青 中国三叶青育苗基地提供，60℃干燥，粉碎后过200目筛；芦丁标准品（纯度≥95%）中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；其余试剂 均为国产分析纯。

M-700微射流均质机 美国Microfluidics公司；GY50-6S高压均质机 上海华东高压均质机厂；722G可见分光光度计 上海精科仪器有限公司；METTLER-TOLEDO AL104电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DFY-500摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 准确称取芦丁标准品5mg，溶解于95%乙醇中，再移入50mL容量瓶并用乙醇定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的芦丁标准液。分别吸取标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于10mL比色管中，并用95%乙醇加至5mL，加入5%的NaNO2溶液0.5mL，摇匀，放置6min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，摇匀，放置6min后，加入4%的NaOH溶液4mL，摇匀，放置15min，以试剂作空白参比液，在510nm处测定其吸光度，以芦丁质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 三叶青叶黄酮提取的流程 三叶青叶粉末→60℃烘干（12h）→乙醇浸润（过夜）→高压预均质（30MPa，2次）→动态超高压微射流均质→乙醇冷凝回流提取（70℃，2次，合并提取液）→离心→抽滤→测定吸光度→计算黄酮得率。

1.2.3 三叶青叶黄酮得率的计算 取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法测定其在510nm下的吸光度，按照下式计算黄酮的得率。

1.2.4 单因素实验 乙醇浓度，提取温度、时间、次数，微射流均质压力、次数及料液比为影响三叶青叶黄酮得率的因素。通过考察文献并结合前期研究，确定液料比为22mL/g，提取次数为两次。本实验主要研究乙醇浓度、提取温度和时间、微射流均质压力和次数五个因素对三叶青叶黄酮得率的影响。

1.2.5 响应面实验设计 以单因素实验为基础，根据Box－Behnken的中心组合原理设计四因素三水平，选择乙醇浓度、提取温度和时间、微射流均质压力为自变量，并以X1、X2、X3、X4来表示，以－1、0、1代表不同变量水平进行编码[15]。实验因素水平及编码见表1。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线回归方程：A=6.7657C+0.0009，R2=0.9997，线性范围：0～0.05mg/mL，在此范围内其吸光度值与浓度呈良好的线性关系。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对三叶青叶黄酮得率的影响 分别称取5.00g三叶青叶粉末，按液料比22mL/g加入分别为50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30MPa预均质后，立刻在100MPa微射流压力下处理2次，70℃水浴提取1.5h，提取两次。

由图1可知，三叶青叶黄酮得率随着乙醇浓度的上升而增大，并且在乙醇70%时达到最大值；随着浓度的继续上升，黄酮得率缓慢下降，其原因可能是当乙醇浓度大于70%，叶绿素等脂溶性杂质溶出影响黄酮类物质的溶解。因此，选择乙醇浓度为70%较合适。

2.2.2 提取温度对三叶青叶黄酮得率的影响 提取温度选择50、60、70、80、90℃，以70%乙醇提取，其余条件同2.2.1。

由图2可知，三叶青叶黄酮得率随着提取温度的上升而增加，且能显著影响三叶青叶黄酮得率。但当温度超过70℃后，黄酮得率随着温度的上升而缓慢下降，其原因可能是三叶青叶黄酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，选择提取温度为70℃较合适。

2.2.3 提取时间对三叶青叶黄酮得率的影响 提取时间选择0.5、1、1.5、2、2.5h，以70%乙醇提取，其余条件同2.2.1。

由图3可知，三叶青叶黄酮得率随着时间的延长先增加而后趋于平缓，在1.5h内时，黄酮得率升高较快，而超过1.5h后，黄酮得率变化不大。因此，选择提取时间为1.5h较合适。

2.2.4 微射流均质压力对三叶青叶黄酮得率的影响

微射流均质压力选择60、80、100、120、140MPa，以70%乙醇提取，其余条件同2.2.1，并与普通提取和30MPa预均质后提取比较。

由图4可知，相对于普通提取和高压预均质后提取，微射流均质后提取使得三叶青叶黄酮得率随着均质压力的上升而显著提高，其原因可能是均质压力越大细胞破碎程度越高，从而导致黄酮类物质更完全的溶出。黄酮得率在压力为100MPa时达到最大值。而后随着均质压力的上升黄酮得率趋于平缓且略微下降。因此，微射流均质压力100Mpa时，黄酮得率最大。

2.2.5 微射流均质次数对三叶青叶黄酮得率的影响

微射流均质次数选择1、2、3、4、5次，以70%乙醇提取，其余条件同2.2.1。

由图5可知，三叶青黄酮得率开始时随着均质次数缓慢上升随后趋于平缓，但变化不大。因此，选择微射流均质次数为2次较合适。

2.3 响应曲面优化实验的结果与分析

2.3.1 响应面优化实验结果 响应面优化实验设计及结果见表2。通过SAS v9.2软件对实验数据进行回归分析，根据Box－Behnken的中心组合设计原理，四因素三水平实验的取值见表1，共有27个实验，实验号1～24为析因实验，后面3个为中心实验。其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差。

2.3.2 拟合模型的建立 对实验数据经回归拟合后，得到X1（乙醇浓度）、X2（提取温度）、X3（提取时间）和X4（微射流均质压力）与Y（三叶青叶黄酮得率）之间的回归方程为：

2.3.3 方差分析 对三叶青叶黄酮得率进行响应曲面回归分析，其结果见表3。

由表3可知，各因素对三叶青叶黄酮得率的影响为：微射流均质压力＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度。本模型的p＜0.0001，说明该模型具有高度的显著性。本实验中X4（微射流均质压力）的一次项对三叶青叶黄酮得率呈极显著水平，X2（提取温度）的一次项呈显著影响。X1（乙醇浓度）、X2（提取温度）、X3（提取时间）的二次项呈显著影响。而X1、X2、X3、X4四者之间的交互作用影响不显著。同时，该模型的R2=0.9588，且模型误差显著、失拟误差不显著，变异系数（CV=2.285）较小，说明此模型能够较好的拟合实际实验。因此，可用该模型代替实验真实点对结果进行分析和预测。

2.3.4 最佳条件的确定及验证性实验 通过SAS软件分析得到微射流均质提取三叶青叶黄酮的最佳条件为：乙醇浓度75%、提取温度70℃、提取时间1.5h、微射流均质压力120MPa，在此条件下三叶青叶黄酮得率的理论预测值为3.52%。然后，按照上述条件做3次平行实验进行验证，得到三叶青叶总黄酮得率的平均值为3.49%。与理论预测值3.52%相比误差仅为0.03%，因此，采用响应曲面法得到的最佳条件具有实用价值。

3 结论

本实验研究了动态超高压微射流对三叶青叶黄酮得率的影响。通过响应曲面法确定了微射流均质热醇提取三叶青叶黄酮的最佳条件：乙醇体积75%、提取温度70℃、提取时间1.5h，微射流均质压力120MPa、微射流均质次数2次、液料比22mg/mL、提取次数2次。此时，三叶青叶黄酮得率为3.49%。

[1]江苏新医学院，中药大辞典[M].下册.上海：上海人民出版社，1977：2123.

[2]中国医学科学院药物研究所中药志[M].第二册.北京：人民卫生出版社，1984：219.

[3]陈科敏，石森林，黄林群，等.三叶青总黄酮的提取工艺研究[J].制剂技术，2009，18（11）：33.

[4]钱丽华.三叶青的离体快速繁殖[J].植物生理学通讯，2008，44（1）：121－122.

[5]郑军献，胡轶娟，梁卫青，等.紫外可见分光光度法测定三叶青中总黄酮含量[J].中国中医药科技，2009（2）：126.

[6]杨学楼，罗经，孙松柏，等.三叶青抗病毒作用的研究[J].湖北中医杂志，1989（4）：40.

[7]Abdul L Flavonols，Ellagic Acid and Anthocyaanidins in Leaves of Some Malaysian Vitaceae[J].Malaysian Journal of Medical Sciences，1980（6）：95.

[8]LIU Wei，LIU Jianhua，LIU Chengmei，et al.Activation and conforma－tional changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：142－147.

[9]刘成梅，钟业俊，刘伟，等.瞬时高压作用对谷草杆菌的杀灭模型[J].食品科学，2006，27（6）：96－99.

[10]涂宗财，王艳敏，刘成梅，等.动态超高压微射流技术在玉米花粉多糖提取中的应用[J].食品工业科技，2010，31（6）：212－214.

[11]涂宗财，王辉，刘成梅，等.动态超高压微射流对蛋清蛋白溶液的粒度和流变性影响[J].食品科学，2007，28（6）：27－29.

[12]涂宗财，张雪春，刘成梅，等.超高压微射流对花生蛋白结构的影响[J].农业工程学报，2008，24（9）：306－308.

[13]涂宗财，张博，任维，等.超高压微射流对玉米淀粉机械力化学效应的研究[J].食品工业科技，2008（2）：172－174.

[14]涂宗财，朱秀梅，陈钢，等.动态超高压微射流对糯米淀粉结构的影响[J].光谱学与光谱分析，2010，30（3）：834－837.

[15]黄璞，谢明勇，聂少平，等.响应曲面法优化微波辅助提取黑灵芝孢子多糖工艺研究[J].食品科学，2007，28（10）：200－203.