孙俊良,梁新红,郭祖峰,唐 玉,李元召
(河南科技学院食品学院,河南新乡 453003)
甘薯渣是甘薯淀粉加工过程中的副产物,不易贮运,大部分在生产过程中被当做废弃物丢弃,仅有少量被简单加工为饲料,这不仅造成环境的污染,也是对甘薯渣中丰富的果胶资源的极大浪费。研究表明,甘薯渣中有20%左右的果胶[1],因此提取甘薯渣中果胶资源,开发高附加值产品是甘薯加工业亟待解决的问题。为了提高果胶的品质,在提取果胶时,需对提取液进行纯化,以除去杂质,如色素、糖、蛋白质等。常用的溶液脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)[2]。常用的吸附剂包括可再生吸附剂如活性炭、分子筛、硅胶、离子交换纤维、活性氧化铝等和不可再生吸附剂,如各种天然矿物(酸性白土、膨润土、硅藻土)、工业废料(煤渣、粉煤灰)及天然废料(木炭、锯屑)等[3]。除蛋白质的方法有蛋白酶水解法、TCA(三氯乙酸)法、Sevage法、鞣酸沉淀法、三氟三氯乙烷法、大孔吸附树脂法[4]。本文选用4种脱色方法,即活性炭法、硅藻土法、超滤膜和离子交换树脂法对甘薯果胶脱色处理,以果胶得率、透光率为指标,筛选出最好的脱色方法;用蛋白酶水解法去除提取液中的蛋白质,以进一步提高果胶纯度。
甘薯 徐薯18号;活性炭 天津市塘沽区鹏达化工厂;001×7(732#)离子交换树脂 天津市科密欧化学试剂有限公司;硅藻土 化学纯,北京旭东化工厂;木瓜蛋白酶 广西杰沃生物公司;其他试剂 均为分析纯。
Alphal-4LSC冷冻干燥机 德国CHRIST公司;RC5C型冷冻离心机 美国Sorvall Znstruments(Du Pont)公司;PS-50型实验用膜分离装置 上海亚东核级树脂有限公司;透析袋 规格为截留分子量8000以上的大分子物质;DEAE Sepharose CL-6B柱,2.6cm×20cm 上海锐谷生物科技有限公司;Sepharose CL-6B柱 1.6cm×100cm,上海锐谷生物科技有限公司。
1.2.1 甘薯果胶提取工艺流程 甘薯渣→加入提取剂提取→离心(转速、时间)→过滤→滤液脱色→脱蛋白→抽滤→超滤→甘薯果胶提取液。
1.2.2 甘薯果胶提取液浓缩 利用提取后果胶用滤布趁热过滤,收集滤液。用冷冻离心机对滤液进行离心,取上清液抽滤后进行超滤。浓缩至原体积的50%,收集滤液,均分为四份备用。
1.2.3 不同脱色方法的比较
1.2.3.1 活性炭脱色 活性炭在使用前活化:加200g碳粉置于1L盐酸浓液(1份盐酸+9份水)中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止(用5%亚铁氰化钾或1%硫氰酸钾检验,不出现蓝色或红色),置于110~120℃烘箱中干燥,备用。
称取一定量粉末状的活性炭溶于少量的溶剂中,按比例加入到上述一份经超滤的果胶提取液中,搅拌混匀,静置3h,4000r/min离心30min除去沉淀,两层滤纸抽滤,收集果胶液。将果胶提取液的pH调至5.0,分别加入0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%(W/V)的粉末活性炭,于50℃下水浴40min,其间应充分搅拌,过滤后于320nm[5]波长下测定吸光度。滤液用乙醇沉淀后冷冻干燥,计算得率。
1.2.3.2 树脂脱色处理 离子交换树脂使用前处理:树脂先用10%NaCl溶液浸泡24h,使其充分溶胀后以蒸馏水逐渐稀释,浸泡,再洗至出水清亮,而后用2倍体积的95%乙醇浸泡24h,用湿法装入规格为2.6cm×20cm的层析柱,用去离子水清洗至无乙醇为止,再用流速为10mL/min的2%HCl溶液进行酸处理120min后,以蒸馏水洗至中性。用流速为10mL/min的5%NaOH溶液对树脂进行碱处理120min后,以蒸馏水洗至中性。另取一份经超滤的果胶提取液过柱子脱色。离子交换树脂脱色,温度选择25℃,流速为5.0mL/10min得滤液。于320nm波长下测吸光度。然后将滤液用乙醇沉淀后冷冻干燥,计算得率[6]。
1.2.3.3 硅藻土处理 称取一定量的硅藻土,加入到果胶溶液中,搅拌混匀,静置3h,先离心除去沉淀,再进行抽滤,可以加快过滤速度,滤液于320nm波长下测吸光度。然后将滤液用乙醇沉淀后冷冻干燥,计算果胶得率。
1.2.3.4 超滤膜处理 将果胶溶液过超滤膜,膜截留分子量为50ku,压力0.10MPa,浓缩到为原体积的1/4,加入蒸馏水恢复原体积,重复操作数次[7]。得滤液于320nm波长下测吸光度。然后将滤液用乙醇沉淀后冷冻干燥,计算果胶得率。
1.2.4 木瓜蛋白酶去蛋白 Sevage法使蛋白变性,条件温和,效果不理想,一般需重复5~10次,耗时长,且果胶损失率高;TCA法脱除蛋白质费时较短,但三氯乙酸法易造成糖苷键断裂和蛋白质变性;三氟三氯乙烷法研究较少。
调整pH为5.7,加入果胶质量0.2%的木瓜蛋白酶,60℃下处理1h,过滤,离心,测蛋白含量,将滤液加乙醇沉淀,干燥。
1.3.1 脱色率的计算方法 计算公式如下[2]:
其中,溶液吸光度均在320nm波长处测得。
1.3.2 果胶得率的计算方法 计算公式如下:
1.3.3 脱蛋白率计算方法 计算公式如下:
1.3.4 蛋白含量的测定 考马斯亮蓝法[9]。
式中:a为根据标准曲线求得的提取液中蛋白质的含量。
牛血清蛋白质标准曲线如图1所示。
由实验获得的标准曲线可知,吸光度与蛋白质含量关系的线性回归方程为:y=0.0077x+0.0388,R2为0.9908,可知其线性关系良好。
活性炭用量对果胶提取液脱色效果的影响,结果见图2。
由图2可知,果胶溶液的脱色效果随着活性炭用量的增大而增强,果胶得率却随之有所降低。当活性炭量为3.0%时,活性炭对色素的吸附能力折线变为平缓,而果胶得率持续下降。故选取活性炭用量为2.0%,温度50℃,脱色时间为40min为最佳脱色条件。
按1.2.3.2实验条件下,经树脂处理过的果胶液脱色率达到66.37%,活性炭与树脂的脱色效果差异不明显(见图3)。
实验还发现,活性炭脱色后的果胶产品颜色发暗,且灰分含量高,而树脂脱色的产品较好,这是由活性炭脱色后除碳不彻底造成的。树脂脱色不仅能够实现生产操作自动化,连续化生产,而且工艺操作简单,大大降低工人劳动强度,提高效率,所以树脂更适合工业化生产。
硅藻土脱色原理:内部有很多微孔,原土的孔体积为0.4~0.9mL/g,精制品的孔体积为1.0~1.4mL/g,比表面积达20~70m2/g。因此,它有良好的吸附性能,特别是善于吸附截留溶液中的悬浮微粒,将溶液加硅藻土过滤能得到清亮的滤液。结果如表1所示。
硅藻土处理后果胶颜色明显变浅,但脱色效果并不显著。果胶有损失,可能是因为硅藻土有微孔,对果胶有一定的吸附作用。
按照1.2.2对果胶进行超滤浓缩,结果见表2。回收率为85%~92%,可能是因为分子量较小的糖和果胶被分流出一部分,或粘在了超滤膜上,脱色率很明显,但不如活性炭和离子柱效果好。但此法工艺简单,脱色与去除其他小分子可同时进行,成本低,适合工业化连续生产。
木瓜蛋白酶在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质,最适pH5.7。用木瓜蛋白酶,调整pH为5.7,加入果胶质量0.2%的木瓜蛋白酶,在60℃下处理1h,过滤,离心,测蛋白含量,结果如表3所示。
用酶法除蛋白后,仍有少量的蛋白质(0.99μg/g)存在果胶中,这可能是因为部分蛋白与果胶结合的原因;果胶的损失可能是因为除蛋白时的沉淀造成的。
活性炭和树脂有较好的脱色效果;但活性炭脱色后的果胶产品颜色发暗,且灰分含量高;树脂脱色效果比用活性炭好;超滤膜脱色得率为85%~92%,此法工艺简单,且脱色同时还可以去除其他小分子物质,成本低,适合工业化连续生产。用酶法可以除去绝大部分蛋白;果胶的得率可以达到96.81%。在纯化效果上,活性炭脱色适合实验室制备高纯度果胶;而超滤法则适于纯度要求略低的工业化生产。
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