微山湖河蟹养殖水域可培养好氧异养细菌多样性调查

杨 军， 毛慧文， 王玉芹， 孟荣江， 李罗英， 周 晶

(曲阜师范大学 生命科学学院， 山东 曲阜 273165)

微山湖是南四湖的别称，由微山、邵阳、南阳、独山四个彼此相连的湖泊组成，即广义的微山湖，承接苏、鲁、豫、皖4省的来水，南北全长230 km，宽6.8～27.6 km，流域面积31 700 km2，主体属山东省济宁市，是中国第六大淡水湖，也是中国北方最大的淡水湖.该湖物产丰富，水资源门类齐全，内有丰富的矿产资源，是中国重点煤炭基地之一，也是国内著名风景旅游区之一.异养细菌是水生态系统的分解者和小型滤食性动物的饵料，在湖泊生态系统的物质循环和能量流动中具有重要的作用[1-3].同时，水体的生态状况不同，细菌群落的组成也有差异，且现在有关微山湖的研究报道较少，因而，本文研究了异养细菌群落组成的差异，对微山湖河蟹养殖水域细菌群落的时空分布进行分析，以期为微山湖的水环境保护、渔业资源可持续发展提供理论依据.

1 实验材料和方法

1.1 培养基

LB液体培养基，LB富集固体培养基.

1.2 水样、泥样采集

于2010年11月5日，微山湖河蟹养殖区(北纬34°35′45″，东经117°16′20″)，水样在水面下30 cm处采集，表层泥样用日产Ekman Birge采泥器采集.

1.3 微山湖中可培养异氧细菌的的计数和鉴定

1)采用10倍稀释法对水样梯度进行稀释；取各梯度稀释液分别涂布在LB固体培养基上进行富集培养；25℃培养至形成菌落.

2)密集观察菌落形态[4-9]，并进行群落统计，即根据菌落的表面形状、隆起状况、边缘形状、色泽、透明感来判断菌落类型，结合细胞形态、革兰氏染色及接触酶和氧化酶反应特性进行生物多样性的分析.

3)选择具有独特形态的优势菌落，纯化后进行生理生化试验，按《常见细菌系统鉴定手册》，并参照Bergey氏细菌鉴定手册进行鉴定.

1.4 群落多样性分析

群落多样性用丰度(S) 、优势度(P)、Simpson指数(L)和Shannon-Wiener指数(H)来表示.具体计算方式如下.

S：用样品中所含的不同形态特征的菌落种类数来表示.P：用某一类型的菌落数所占的比例来表示，即Pi=ni/N.L：指样品中随机得到的两个分离物为同一类型菌落的概率.L越小，表示种群越丰富，种群分布越均匀.

H是反映群落多样性与均匀度的复合参数.H越大，表示生物多样性越高.

其中S为样本中不同类型的菌落数量，ni为样本中某一特定类型菌落的数量，pi为某一特定类型的菌落数量占总菌落数的比例，N为样本的菌落总数[8].

2 结果与分析

2.1 微山湖河蟹养殖水域中可培养异氧细菌的计数

于2010年11月5日，对微山湖河蟹养殖区(北纬34°35′45″，东经117°16′20″)水体和表层底泥中可培养异养细菌进行了分离,发现作为富营养化湖泊的微山湖,水体中可培养异养细菌的数量很多，全湖平均值有1.70×104cfu /mL，一般认为自然水体中细菌总数100～1000cfu/mL为清洁水，大于105cfu/mL则为极不清洁水，这说明微山湖河蟹养殖区水质污染严重：有机污染物处于较高的水平，这就导致有机营养型的异养细菌数量很多.这与近年对其湖水有机物超标率达60%以上，湖水富营养化程度严重的研究结果相似.另外，采样期间气温较低，细菌的繁殖速度降低，而可培养异养细菌数量却不低，这就更加反映了其富营养化程度的严重性；另一方面也可能是由于气温较低，不利于藻类和原生动物的繁殖，而微山湖又是许多鸟迁徙必经的中转站，据调查，仅9-10月南北往来或中途在此居留觅食的旅游鸟就有96种，综合各因素，导致采样期间养殖区内藻类和原生动物的生物量不十分丰富，使水体中异养细菌可利用的可溶性有机碳含量较高.

表层底泥中可培养异样细菌的数量平均为1.2×105cfu/g(以干泥计，下同)，从采样时间看，气温较低，细菌的繁殖速度也会随之降低，但此季节底泥中微生物的生物量仍相对较高，这更加说明底泥中有机污染程度严重，当然也可能是由于底栖原生动物不活跃的原因造成的.

2.2 菌落形态观察和群落统计

微山湖水体中的可培养异养细菌的菌落类型很少，在从河蟹养殖区水体和表层底泥中分离到的25株菌的初步鉴定过程中，我们得到的结果是：2，11，19，20这4株菌属于气单胞菌属(Aeromonas)，4属假单胞菌属(Pseudomonas)；1，3，6，8，13，14，15，17，23这9株菌属于芽孢杆菌属(Bacillus)；8属于硝化杆菌属(Nitrobacter)；5，9，12属于乳杆菌属(Lactobacillus)；10，16，18，21，22，24，25属于链球菌属(Streptococcus).

2.3 微山湖河蟹养殖水域可培养异养细菌的群落多样性

对微山湖河蟹养殖水域可培养异养细菌的生态调查见表1、2.表中结果显示，水体中存在的主要是革兰氏阳性菌 (占93%左右)，以芽孢菌属、链球菌属和气单胞菌属占优势，革兰氏阴性菌较少，球形菌较少，且没有产色素的菌.芽孢杆菌的比例相对较高，平均43.75%,这可能与季节转换期温度变化较大，对环境适应能力强的芽孢菌能较多地存活下来有关.

另外，我们还看到，底泥中存在的主要是革氏阴性菌(占62.5%)，以链球菌属占优势(占62.5%)，多杆状或棒状菌，产色素菌相对较高，占44.4%.底泥中只含有3种类型的菌落，说明济宁微山湖中异养细菌的种群不丰富，物种多样性较差.

调查还发现微山湖河蟹养殖水域优势菌的优势度高, 多样性指数低(表3).水体中优势菌的优势度为43.75%，多样性指数H为1.542.底泥中优势菌的优势度为55.56%, 多样性指数H为0.994 9.微山湖河蟹养殖水域异养细菌分布的特点是以有芽孢的革兰氏阳性杆菌占绝对优势(93%左右)，革兰氏阴性菌很少，多为气单胞菌属或链球菌属，这与我国其他淡水湖泊细菌群落有所不同，这可能是由当地养殖区的特殊环境造成的.

总之，对微山湖河蟹养殖水域中细菌多样性和群落结构的研究有助于对其水环境的综合评价及治理提供参考，也为对微山湖微生物资源的进一步了解和开发打下了基础.

3 讨论

3.1 水温对水域异养细菌分布的影响

温度是影响生物酶活性的重要因子，从季节变化看，水温增加对细菌增殖具有一定的促进作用，这与其它很多研究者调查结果一致[10]，在此次调查期间内，11月份为初冬季节，水温较低，水环境中的很多营养物质比较难以利用，再加上水产动物和植物较少，这也许是影响此次水域异养细菌多样性分布的主要原因.

3.2 河蟹养殖对水域异养细菌数量的影响

研究报道鱼类养殖产生的残饵、粪便及残骸等可造成底泥有机质富集，与之相比，本研究水域有机质分布便呈现较高的分布特点.有机质含量的高低形成了与之相应的异养细菌丰度，与已有研究报道的有机质可刺激细菌生长[11]的结果一致.

3.3 河蟹养殖对水域异养细菌多样性的影响

已有研究显示，养鱼场和对照点底泥细菌群落结构存在较大差异，养鱼场底泥革兰氏阴性菌比对照点革兰氏阴性菌所占比例高，对照点革兰氏阳性菌往往占多数.如 Chelossi 等[12]研究发现沿海养鱼场沉积物中有超过30%的革兰氏阴性菌，对照点( 距养殖场200 m)革兰氏阴性菌很少，革兰氏阳菌占81%.Vezzulli等[11]对西地中海海区一养鱼场沉积物微生物群落的研究发现，养殖区沉积物中异养细菌CBF(Cytophaga/Flexibacter-likebacteria)占优势，且存在弧菌等病原菌，而对照点(距养殖场200 m)革兰氏阳性菌数量达到总菌数的90%.本研究结果显示，微山湖河蟹养殖水体中优势菌的优势度为43.75%，多样性指数H为1.542.底泥中优势菌的优势度为55.56%，多样性指数H为0.9949.微山湖河蟹养殖水域异养细菌分布的特点是以有芽孢的革兰氏阳性杆菌占绝对优势(93%左右)，革兰氏阴性菌很少，多为气单胞菌属或链球菌属，研究证明了污染物的长期排放将降低自然生态系统中微生物多样性，该结果也在本研究中得到了佐证.

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