利用rDNA－ITS研究立枯丝核菌的遗传多样性

王利红，姜 华，王艳丽，孙国昌

（1．杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036；2．浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州310021）

立枯丝核菌（RhizoctoniasolaniKühn）是一种植物病原真菌，能侵染27科以上的植物，其中包括许多重要的粮食作物如水稻、小麦、玉米等［1］．R．solani被普遍认为是一个集合种（collective species）［2］，不同寄主来源的R．solani在形态、致病性和生理方面存在极大的差异［3－4］．1936年Schultz［5］首次提出了菌丝融合群（Anastomosis group，AG）的概念，即根据不同来源R．solani菌株的菌丝融合情况，将其分成不同的融合群［6－7］．尽管菌丝融合群的提出与广泛应用便利了R．solani遗传多样性的研究，但由于该菌在群体遗传和地域差异上表现出巨大的复杂性，人们一直在探求研究R．solani遗传多样性的新方法和技术．

真菌核糖体rDNA－ITS序列包括18SrDNA、转录间隔区1（internal transcribed spacer 1，ITS1区）、5．8SrDNA、转录间隔区2（ITS2区）和28SrDNA（图1）．鉴于最终成熟的核糖体并不包括转录间隔区ITS（ITS1和ITS2），因此相对于18S、5．8S和28SrDNA区域的高度保守性，ITS区域有着非常丰富的遗传变异，从而为R．solani遗传多样性研究提供了理论基础［8］．虽然18S和28SrDNA区不及ITS区域遗传多样性丰富，但该区域也可以在融合群水平上研究R．solani的遗传多样性［9－10］．因此，本文以整个rDNA－ITS区域为对象，综述rDNA－ITS技术的实现、在实际研究中的应用及目前的研究进展．

图1 R．solanirDNA－ITS及该区域PCR扩增引物示意图Fig．1 The sketch map of rDNA－ITS and PCR primers for amplification of this region of R．solani

1 利用rDNA－ITS研究R．solani遗传多样性的方法

1．1 直接测序

直接测序是目前最为快速的rDNA－ITS分析方法之一．在R．solanirDNA－ITS测序过程中，选择合适的引物是首要条件，相关研究中使用的rDNA－ITS扩增的引物列于表1．根据实验目的，选择合适的引物，利用PCR仪扩增R．solani的rDNA－ITS并采用双脱氧终止法［11］对PCR产物直接测序．虽然测序费用相对较高、整理数据略显复杂，但过程简单、快速、准确率高且获得的信息量大，因此，被广泛应用于R．solaniAG－1［12］，AG－2［13－14］和AG－4［15］遗传多样性的研究中．

表1 扩增R．solanirDNA－ITS区域常用引物Tab．1 The list of common used primers for amplifying the rDNA－ITS region of R．solani

1．2 限制性片段长度多态性（RFLP）

RFLP是基于rDNA－ITS序列的酶切位点由于碱基突变或发生插入、缺失、易位和倒位等，导致酶切片段发生变化，从而可以通过琼脂糖凝胶电泳图谱的差异，比较不同R．solani菌株DNA水平的多态性．Liu等［13］首次通过rDNA－ITS的RFLP酶切图谱来研究R．solani的遗传多样性，随后RFLP就被广泛地应用于该菌遗传多样性的研究中［20－25］．rDNA－ITS由于片段小，其RFLP无需利用探针进行杂交［26］，实验过程简单，数据分析便捷．rDNA－ITS片段RFLP分析的一般流程：利用适合引物（表1）扩增rDNA－ITS区域；选择不同的限制性内切酶对扩增片段进行酶切，利用琼脂糖凝胶电泳区分不同酶切片段；分析相关R．solani菌株的遗传多样性．虽然RFLP法依赖于限制性内切酶，多态性降低，但该法结果稳定且重复性好．

1．3 直接测序和RFLP数据处理

1．3．1 直接测序

测序的快速发展，帮助研究者获得了大量rDNA－ITS序列信息．目前较为普遍的rDNA－ITS序列分析流程：选取测序结果准确的区间，利用CLUSTALW进行不同菌株间rDNA－ITS序列比对；根据比对结果利用MEGA软件［27］计算转换／颠换值（transition／transversion，Ti／Tv）及碱基平均含量；构建系统进化树，用以描述各融合群间的进化关系；利用DnaSP软件分析rDNA－ITS序列的变异位点，推导单倍型数目，计算单倍型多样性、核苷酸多样性，进而研究R．solanirDNA－ITS序列代表的菌株遗传多态性．

1．3．2 RFLP

利用RFLP可获得大量酶切片段，将每个酶切片段看作一个遗传位点，不同大小的酶切片段按有无分别记为1和0，形成多态性矩阵，并计算菌株间相似程度［28］，获得相似系数矩阵：F（相似系数）＝2nxy／（nx＋ny），其中nxy为两个菌株间共有的片段数，nx，ny分别为两个菌株各自的片段数；聚类分析，从而把不同的R．solani菌株依据亲缘关系远近聚类成不同的类群［29］．

2 rDNA－ITS在R．solani遗传多样性研究中的应用

2．1 直接测序在研究R．solani遗传多样性中的应用

利用rDNA－ITS区域序列测定研究R．solani不同融合群的遗传多样性表明AG－1［12，30－31］、AG－2［13－14］、AG－3［32］、AG－4［8］和AG－6［33］菌株间存在很大的变异性．Kuninaga等［8］研究了AG－1的8个菌株，发现ITS1片段大小为198～227bp，ITS2为267～283bp；相同亚群的ITS1同源性为99．5%～100%，ITS2同源性为96．4%～100%；不同亚群的ITS1同源性为66．7%～80．4%，ITS2同源性为88．6%～92．6%．这表明在AG－1中，相同亚群ITS序列同源性极高，不同亚群ITS序列变异性较大，通过邻接树也显示AG－1的3个亚群之间存在一定的遗传距离．同时对AG－3的9个菌株的序列分析显示ITS1大小为218～222bp，ITS2为270～272bp，且分离自番茄和烟草的菌株有相同的ITS序列，分离自马铃薯的菌株，ITS1序列同源性为96．8%～98．6%，ITS2同源性为99．6%～100%；不同寄主菌株间ITS序列分析表明分离自马铃薯和番茄的菌株序列同源性为96．8%～98．5%，但与分离自烟草的菌株同源性为91．0%～95．2%；邻接树分析显示分离自马铃薯和烟草的AG－3菌株彼此系统进化距离远，这表明rDNA－ITS可有效地用于评估融合亚群的遗传多样性．Carling等［34］对AG－13的ITS分析显示ITS1为210bp，ITS2为282bp；对来源AG－13的6个菌株的序列分析表明其ITS1序列完全相同，ITS2序列同源性达到99%～100%；当AG－13的ITS序列与其它融合群进行比较时，ITS1序列同源性达到68%～85%，ITS2同源性达到85%～95%；通过邻接树显示AG－13与AG－4不在一个群里，但与其它融合群都可以聚在同一个群里．Fiers等［35］利用rDNA－ITS测序法分析分离自土豆块茎的73株R．solani遗传多样性，发现60个菌株属于AG－3PT，8个菌株属于AG2－1，5个菌株属于AG－5，其遗传多样性极其丰富．

根据rDNA－ITS区域序列的特异性，设计以诊断为目的的PCR引物，可检测和鉴定某些融合群和亚群．Carling等利用ITS2、3、4、5、NS7［16］和LR3［19］扩增AG－2－1、－2－2IIIB、－2－2IV、－2－2LP、－2－3和－2－4的ITS序列，通过比较ITS1和ITS2之间序列的差异，设计了可特异性扩增各亚群的引物（表2），能快速、可靠地鉴定AG－2的亚群［36］．类似地，Kuninaga等［32］设计了可特异性扩增亚群3－PT和3－TB的引物PT1／PT2和TB1／TB2（表2），用于快速鉴定AG－3的亚群．Lees等［37］设计了可特异性扩增AG－3的引物Rs1F2／Rs2R1（表2），用于与其它融合群区分．

2．2 RFLP在研究R．solani遗传多样性中的应用

Liu等［13］采用DNA限制性内切酶分析AG－2的70个菌株，酶切图谱显示2A、2B、2C、2D和2E有相同的5．8SrDNA，但PCR扩增的rDNA－ITS片段大小有所不同，2A和2E片段均为690bp，2B、2C和2D片段大小为740bp，表明这5个亚群在ITS区域存在差异．通过EcoRI可区分2A和2E亚群，MspI或TaqI可区分2B、2C和2D亚群．Liu等［12］还根据rDNA－ITS限制性图谱对来源于不同地区的9个融合群进行研究：在AG－3中PCR扩增rDNA－ITS，虽然扩增片段大小均为700bp，但可通过MboI酶切区分出两个亚群3A和3B；在AG－4中PCR扩增出700bp和720bp 2条片段，且通过MboI酶切分成两个亚群4A和4B；在AG－5中PCR扩增出3条大小不同的片段，分别为680、710、650bp，通过HaeIII和MspI酶切可把AG－5分成3个不同亚群5A、5B和5C．此外，Liu等［12］还发现AG－9的6个菌株在rDNA－ITS区域有相同的DNA限制性图谱，属于同一个群；AG－10通过PCR扩增出的片段最短，经HinfI酶切和MspI、TaqI双酶切，可分为两个亚群10A和10B；AG－BI通过PCR扩增出的片段最长，为740bp，可与其它融合群相区别．Guillemaut等［38］比较了不同地理位置和寄主范围的219株菌株rDNA－ITS区域的限制性内切酶图谱，显示内切酶MseI、AvaII、HincII和MunI在rDNA－ITS区产生了40个RFLP类型．另外，通过Fnu4HI酶切可区分AG－6和AG－12，MseI、AvaII、HincII和MunI共同酶切还可区分AG－1、AG－2、AG－3和AG－4的亚群．

表2 鉴定融合群和亚群的特殊引物Tab．2 The specifical primers for identification anastomosis group and subgroups

此外，通过18SrDNA－RFLP和28SrDNA－RFLP也可以研究R．solani的遗传多样性．Liu等［9］用11个限制性内切酶对161个菌株的18SrRNA区域进行限制性分析，获得4种图谱：图谱I代表大部分R．solani亚群；图谱II代表2E和9的菌株，与图谱Ⅰ相比缺少1个限制性位点；图谱III代表5C菌株，较图谱I缺少2个限制性位点；图谱IV有明显的限制性位点变异，代表10A和B菌株．根据数据显示，AG－10与其它融合群亲缘关系较远．Matsumoto等［10］分析了57株菌株28SrDNA的多样性，结果显示AG－1、AG－2和AG－4之间存在多样性；同时发现在AG－1亚群中，用HpaII酶切AG－1－IA的rDNA片段模式与AG－1－IB和AG－1－IC有很大的不同．用HhaI和HpaII酶切AG2－1、2－2IIIB和2－2IV，观察到的片段模式也是不同的．将限制性内切酶结果和聚类分析相结合，表明AG－1和AG－2的亚群又可细分成不同的种内亚群，这些亚群与其它融合群在亲缘关系上很远．

3 讨 论

R．solani是一个相当复杂的集合群，已分成14个国际标准融合群，AG1－AG10在形态、生理、生态、致病性和寄主等方面均存在一定的遗传多样性．最近十几年来，主要通过同工酶组成、脂肪酸含量以及各种分子标记研究该菌的遗传多样性．在各种方法中，由于ITS选择压力小、进化快、有非常丰富的遗传变异，加之R．solani的rDNA－ITS片段仅611～740bp，片段小易于分析，因此，rDNA－ITS分析已成为R．solani遗传多样性的研究中较为常用的方法．

通过直接测序和RFLP分析R．solani的遗传多样性，发现绝大多数融合群又可以分为不同的亚群：Liu等［12］根据RFLP和同工酶技术认为AG－1可分为6个亚群．Salazar等［39］根据ITS序列分析认为AG－2可分为7个亚群．Liu等［20］根据rDNA－ITS区的限制性图谱认为AG－3可分为2个亚群、AG－4可分为2个亚群、AG－5可分为3个亚群，而AG－10可分成2个亚群．这表明即便在相同融合群中也存在着丰富的遗传多样性．

由于选择压力小，ITS1和ITS2区域相比于5．8S，18S和28S区更能累计序列变异．不同融合群的rDNA－ITS区段在扩增片段大小及序列组成上都存在丰富的差异［8，34］．尽管目前纹枯菌的遗传多样性主要通过分析ITS1和ITS2区域而获得，但也有研究表明18S和28S区域也可以对部分融合群进行亚群区分［9－10］，这在一定程度上表明即便是进化相对保守的区段在同一融合群内同样能显现出丰富的变异，利用这些保守的区段也可以研究纹枯菌的遗传多样性，同时也可以帮助理解在这些区段纹枯菌的进化机制．

依据DNA在不同浓度变性剂中解链动态不同，变性梯度凝胶电泳（DGGE）可以将相同片段长度但碱基组成不同的DNA片段分开．鉴于RFLP法受制于限制性内切酶，而测序法成本高很难实现高通量，DGGE无疑为纹枯菌rDNA－ITS分析提供了新的手段．利用其能够区分不同碱基组成片段的特性，可以将同一融合群中rDNA－ITS片段长度一致且只有单核苷酸差异的菌株分开，大大提高了检测的灵敏度，且周期短可比测序法获得更快更丰富的数据．同时可以选择性地对差异片段进行测序分析，从而降低获取差异的测序成本．笔者所在实验室也正在利用DGGE技术对浙江省不同地区的水稻纹枯菌进行分析，初步结果表明浙江省水稻纹枯菌呈现丰富的多态性，对其进一步的研究可以更加完善此项实验技术并更深入地了解省内水稻纹枯菌遗传多样性．

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