微生物培养技术研究进展

陈丽媛，徐 冲

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

自然界中微生物的种数估计有10万种，但发现的仅为10%～20%，而在人类生产和生活中仅开发利用了已发现微生物种类的1%，绝大多数在现有条件下还不能被培养出来。依照现有的培养技术和方法，不同生境微生物可培养率的检测结果如下:海水中约为0.001% ～0.1%，淡水中约为0.25%，土壤中约为0.3%，活性污泥中约为1% ～15%。为了克服现有培养技术方法的局限性，研究人员在提出改进现有微生物培养措施的同时，相继开发出一系列新的微生物培养方法和技术，如稀释培养法和高通量培养法、扩散盒培养法以及细胞微囊包埋技术等，大大提高了微生物培养的数量和种类，对微生物资源的开发及利用具有重要意义。

1 微生物难培养生长的原因

1.1 自然环境的难模拟性

地球上微生物无处不在。如，每克肥沃的土壤约含20亿个微生物，而每克贫瘠的土壤也含3亿～5亿个微生物;一只手含4万～40万个细菌，洗净后约含300个细菌;在85 km的高空、11 km的深海、2 km的地层以及100℃的温泉、－250℃低温环境均有微生物的存在。微生物生存的环境类型也是多种多样的，除了普通的自然环境外，还存在着各种极端环境，尽管人们已经从中分离出一些微生物种群，然而由于极端环境复杂多变，在目前的条件和设备下，自然环境中微生物生长所需要的各种适宜条件在实验室还无法被完全满足，而为了达到研究的目的，通常简化了培养条件。如，由于不了解或不完全了解微生物生长所需的营养成分及某些特定的化学物质，将微生物接种于只具有固定配方的凝固的平板或静止的液体培养基中，并置于恒温、恒湿、黑暗等单一环境中，这样就可能造成那些在自然界中可以生长繁殖的微生物，在纯培养中生长条件得不到满足，从而导致了微生物的不可培养性。

1.2 微生物间的相互关系

在自然界中，多种微生物组成了各种集体环境，它们相互协作，共同完成了各种复杂的物质和能量代谢。微生物间的相互关系虽然很多，但主要可以归纳为种间的共生关系及群体感应。微生物群体之间提供生长所需的生长因子，或通过感知外界环境的变化，来调整群体行为。这些关系是微生物生长所必需的。但人们在进行常规的微生物分离培养过程中，通常会忽视这些群体效应，当微生物从天然环境骤然转入人为设置的培养环境时，原生境中的生态依存关系遭到破坏，菌群间的生物信息交流体系也会发生根本性的改变，适应性强的物种生长迅速，而生长缓慢的微生物类型则因营养物的匮乏以及种群信息流通的障碍而受到抑制。

1.3 人工营养基质浓度过高或氧化环境压力的影响

以传统方法培养时，通常采用营养丰富的培养基，以期达到微生物快速生长和最大生物产量，结果分离的大多为生长迅速且偏爱丰富营养的微生物。而在自然界中，除了一些利用高浓度营养物的微生物种群外，其余大部分微生物是以中低营养甚至是寡营养方式生活的。当微生物从自然环境转移到营养丰富的人工培养基时，一些摄取营养能力强的微生物会应运而生，而寡营养的微生物就会因高浓度营养物基质的抑制而停止生长。另外，自然环境中的微生物在人工培养基上好氧条件培养时，一些适应性强的种类迅速生长，在生长代谢过程中产生大量的过氧化物、自由基和超氧化物，使生长速率较慢或适应能力较差的微生物受到毒害抑制，或者处于休眠状态，甚至死亡。

1.4 判断微生物生长的常规标准不完善

人们在筛选分离新的微生物菌株时，常常根据研究内容的需要，有目的地选用固定的培养基及培养条件进行人工培养，营养成分相对单一。在自然条件下，往往是几种甚至许多微生物混杂在一起，而在实验室条件下接种到人工培养基时，那些适合人工培养条件的微生物摄取了大量营养成分，生长迅速，而生长缓慢的微生物的生长受到了抑制，而用现有的判断微生物生长状况的常规标难以观察到这些微生物的生长，被认为“不可培养”。

2 微生物培养技术的改良措施

目前，实验室使用的常规培养基多为高浓度营养基质。事实上，有研究发现低浓度基质培养出的细菌数量和种类均多于高浓度基质［1-2］。但浓度过低也会降低微生物的培养数量，最适宜的浓度最好与自然界中微生物生长的环境条件相近。例如，在培养土壤微生物时加入土壤浸提液、培养海洋微生物时加入含有少量生长因子的天然海水，可以大大提高所培养微生物的数量及种类［3］。还可通过减少培养环境中的氧分压、以多聚物为碳源、在培养过程中加入可降解毒性氧的物质等，不同程度地减弱毒性氧的毒害作用［4］。另外，以下措施也可有效提高微生物的培养几率。如，通过适当延长培养时间，有可能使某些“寡营养菌”肉眼可见，但培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高，因此培养时间不能无限延长;用古兰糖胶作为培养基固化剂，可以避免琼脂对某些微生物的毒性作用，增加微生物的可培养性［5］;在微生物培养过程中，供应微生物所需的特有底物(如电子供体和受体)，可有助于微生物的正常生长，从而可能发现未知的生理型微生物［6-7］。

3 开发新型培养技术

3.1 稀释培养法和高通量培养法

由于海洋环境中主要是寡营养微生物类群，迄今为止海洋环境中可以培养的微生物的比例仍是地球环境中最低的，因此在人工培养时，它们就会受到来自同一环境中处于生长优势的微生物的抑制而不能生长［8］。稀释培养法认为，当把海水中微生物群体稀释至痕量(103/mL)时，在海水中主要存在的寡营养微生物可不受少数几种优势微生物竞争作用的干扰，因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高［9］。研究人员在稀释培养法的基础上又研究出高通量培养法，即将样品稀释至痕量后，采用小体积48孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅有效提高了微生物的可培养性，还可在短期内监测大量的培养物，大大提高了工作效率［10］。

3.2 扩散盒培养法

扩散盒是Kaeberlein等［11］在分离培养潮间带底泥微生物时使用的一种自制培养仪器，其最大的特点是有效地保证了微生物群落间作用的存在，可比较真实地模拟微生物所处的自然环境，提高微生物可培养性。应用此种改进技术，研究者从环境样品中分离出许多常规方法很难分离的微生物。应当指出，扩散盒技术初次培养获得的微小菌落多数为混合培养，通常需要再次分离，才能获得纯培养。该种方法的特点是:模拟自然环境，不同细胞间经过互喂形成独立的菌落。扩散盒法的主要不足是操作比较繁琐。

3.3 细胞微囊包埋技术

细胞微囊包埋法是近年来出现的一种将单细胞包埋培养与流式细胞仪检测结合为一体的高通量分离培养技术。Zengler等［12］先将土壤样品中的微生物进行稀释，与融化的琼脂糖混合，然后在专门的搅拌器中用油乳化，形成直径30～50 μm的微滴，其中10%的胶滴会含有单个细胞。之后，将包埋胶囊装入层析柱内，层析柱进口端用0.1 μm滤膜封住，防止外部细菌的进入而污染层析柱，出口端用8 μm滤膜封住，低浓度的有机物培养液连续通过层析柱对包埋胶囊进行流态培养，未被包埋的游离细胞则随培养液流出柱外。结合流式细胞仪进行检测，将长有单菌落的胶囊分选到加有丰富培养基的96孔板中继续培养，最终获得纯培养微生物。该种高通量的培养技术可从每个样品中分离出10000多株细菌和真菌［13］。Ben-Dov等［14］研究出一种双层包埋技术，先将微生物包装在琼脂球内，外面用一种多羰基高分子膜包裹，将这种双层包裹的小球放在一种雌性石芝珊瑚的表面黏液层中培养，获得许多新的微生物，与已知细菌序列比较，最大相似性只有85%～96%。Nichols等［15］设计了一种高通量的微生物分离芯片(Ichip)方法，每个芯片包含有数百个微型扩散孔，每个扩散孔只含有一个微生物细胞。采用该种芯片装置，分离到大量的海水和土壤微生物，其中序列最大相似性小于95%的新种分别占28.3%和28.7%。细胞微囊包埋法的优点:在接近于天然生长的环境中有效地提高了微生物的可培养性。

4 小结

近年来，新颖的微生物培养方法和技术陆续问世，大体可归纳为两类:一是在传统的培养基组成和培养方式上进行改良，包括添加微生物相互作用的信号分子，供应新型的电子供体和受体，降低营养基质浓度，延长培养时间以改善微生物的培养条件，促进低营养以及寡营养微生物种类的分离培养等;二是设计仿原生境的高通量微生物培养技术和装置，如用于海洋环境和陆生环境的扩散盒技术、土壤基质膜技术以及高通量的细胞微囊包埋技术等。这些技术的研发极大地丰富了可培养微生物种群多样性的资源宝库，并为开发这些微生物资源奠定了良好的研究基础。然而，由于微生物生存环境极其复杂，未培养微生物数量巨大，种类繁多，因此，在探索微生物学领域的过程中仍面临着巨大的挑战。

［1］Aagot N，Nybroe O，Nielsen P，et al.An altered Pseudomonas diversity is recovered from soil by using nutrient poor Pseudomonas selective soil extract media［J］.Appl EnvironMicrobiol，2001，67:5233-5239.

［2］Bussmann I，Philipp B，Schink B.Factors influencing the cult ivability of lake water bacteria［J］.J Mi crobiol Methods，2001，47:41-50.

［3］Zengler K，Toledo G，Rapp MS，et al.Cultivat ing the uncultured［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，26:15681-15686.

［4］Stevenson BS，Eichorst SA，Wert z JT，et al.New strategies for cult ivation and detection of previously uncultured microbes［J］.Appl Environ Mi crobiol，2004，70:4748-4755.

［5］Janssen PH，Yat es PS，Grinton BE，et al.Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members of the divisions Acidobacteria，Actinobacteria，Proteobacteria，and Verrucomicrobia［J］.Appl Environ Microbi ol，2002，68:2391-2396.

［6］焦瑞身.新世纪微生物学者的一项重要任务－未培养微生物的分离培养［J］.生物工程学报，2004，20(5):641-645.

［7］Leadbett er JR.Cult ivation of recalcitrant microbes:cells are alive，well and revealing their secret s in the 21st century laboratory［J］.Curr Opin Microbiol，2003，6:274-281.

［8］张秀明，张晓华.海洋微生物培养新技术的研究进展［J］.海洋科学，2009，33(6):99-104.

［9］Button DK，Schut F，Quang P.Vialibity and isolation of marine bacteria by dilution culture:theory，procedures，and initial results［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):881-891.

［10］Rappé MS，Connon SA，Vergin KL，et al.Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade［J］.Nature，2002，418(6898):630-633.

［11］Kaeberlein T，Lewis K，Epstein SS.Isolating"uncultivable"microorganisms in pure culture in a simulated natural environment［J］.Science，2002，296(5570):1127-1129.

［12］Zengler K，Toledo G，Rappé M，et al.Cultivating the uncultured［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the U-nited States of America，2002，99(24):15681-15686.

［13］Zengler K，Walcher M，Clark G，et al.High-throughput cultivation of microorganisms using microcapsules［J］.Methods in Enzymology，2005，397:124-130.

［14］Ben-Dov E，Kramarsky-Winter E，Kushmaro A.Anin situ method for cultivating microorganisms using a double encapsulation technique［J］.FEMS Microbiology Ecology，2009，68(3):363-371.

［15］Nichols D，Cahoon N，Trakhtenberg EM，et al.Use of ichip for highthroughput in situ cultivation of"uncultivable"microbial species［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76(8):2445-2450.