不同家蚕品种血液黄酮类化合物含量的测定及分析

马可，方俊清，郑晓敏，陈玉银

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江 杭州 310058）

不同家蚕品种血液黄酮类化合物含量的测定及分析

马可，方俊清，郑晓敏，陈玉银*

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江 杭州 310058）

本研究对浙江大学动物科学学院家蚕种质资源库中四种不同茧色的家蚕品种即绿色茧P50、黄色茧金秋、白色茧玉丰以及红色茧HHM的五龄第1～6天黄酮类化合物含量进行了测定，同时对种质资源库中其他蚕品种五龄第4天血液中黄酮类化合物含量进行了测定，并且分析了不同蚕品种以及不同茧色之间的差异及变化规律。结果显示黄酮类化合物的峰值依品种特性出现在五龄第3或第4天，绿色茧的黄酮类含量变化规律与其他品种截然不同，品种间黄酮类化合物的含量差异很大，可能与品种的全茧量及五龄发育经过长短有关。

黄酮类化合物；家蚕种质资源；茧色

黄酮类化合物是一类天然色素及苷类的总称，是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物。黄酮类化合物已经广泛应用于食品和医药等各个方面。研究表明，黄酮类化合物对人体具有消除氧自由基、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、雌激素样作用，以及保护心脑血管系统、降血糖等生理活性，且毒副作用小的优点。因此黄酮也是评价食品营养价值，开发新的食品资源的一个重要指标。

目前对黄酮类化合物提取的主要原材料来自植物如槐花、银杏、大豆等，动物方面主要有蜜蜂的相

关产品如蜂胶等。国内外学者研究表明用家蚕幼虫制成的全蚕粉具有显著的降血糖作用，这已分别由Ryu等［1］、桂仲争等［2］、陈智毅等［3］、肖辉等［4］在动物实验和临床研究中得到了证实，推测可能与全蚕粉中高含量的黄酮类功能性物质有关。同时研究表明，用5龄第3 d蚕冷冻干燥制成的全蚕粉，较用其它生长发育阶段蚕制成的全蚕粉表现出较高的降血糖作用，所以用于降血糖的全蚕粉均选用5龄第3 d蚕制作。刘淑梅等［5］建立了家蚕幼虫体中黄酮类化合物的测定方法，查明家蚕幼虫体中富含黄酮类化合物。金吉等［6］研究了12个不同品种、不同生长发育阶段、不同性别家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量的变化规律。发现家蚕幼虫体黄酮类化合物含量在蚕品种及杂交组合存在显著差异，高低相差3倍之多；在性别间，雄蚕高于雌蚕；在不同发育阶段随龄期增大而逐渐增加；在5龄期，随生长而逐渐升高，至第3 d达到峰值，此后除第5 d有一小波动外逐日渐下降，至成熟时又稍有上升。该研究所用的材料为生产上实用品种，都为白色茧品种。而家蚕有非常丰富的种质资源库，除白色茧外还有红色、黄色及绿色茧等蚕品种。本研究通过对黄酮类化合物的含量进行测定分析，寻找合适的家蚕种质资源，为特殊功能性家蚕品种的选育提供参考依据，并为家蚕种质资源信息库充实数据。

1 材料与方法

1.1 供试蚕品种

选取浙江大学动物科学学院家蚕资源库中保存的不同系统和化性、品质与茧色有代表性的部分品种，其品种名如下：D93A、新苗A3、新苗、明日A2、明日A、明日B、84MA、GSC、GSJA、YC菁松、YJ皓月、薪2桂、丰一改、薪杭改、白云改、秋丰、白玉、菁松、ZYM、浓绿白玉、云5B白玉、N春菁秋丰、HB、碧莲、Dz白玉、绿秋丰、沔阳红、大团圆、HHM、ZYD、金秋、初日、HB秋丰、ZAU2A、54Nd苏12、B84、法PS黑缟、PMYW、褐圆限性、玉丰、明珠、银丰、P50、皓月B84、丰B84、五四3B84、薪杭3B84、白云3B84、白玉2B84、镇丰3B84、白沔、银丰N、秋丰P、N滞育。

1.2 主要试剂及仪器

芦丁标准品购于Sigma公司，80%乙醇（分析纯），无水甲醇（色谱醇）；岛津UV-2450紫外分光光度计［Shimadzu（suzhou）Instuments Manufacturing,Co., Ltd.］；台式离心机为杭州达科科学仪器有限公司。

1.3 血液样品的制取

每个蚕品种取试样蚕10条，剪去腹足，将血液放出至1.5 m l离心管内。另每个品种取10条，同样操作后，将其保存于-20℃冰箱中供备用。从装有血液样品的1.5 m l离心管中各取100μl血液样品至3个2 m l离心管中，并向其中分别加入1.5 m l 80%酒精进行稀释，供黄酮类化合物测定。

1.4 芦丁标准曲线的建立

称取10 mg芦丁标准品，置于50 m l的容量瓶内，得到0.2 mg/m l的标准溶液。然后分别取标准溶液0、1、2、3、4、5及6 m l后加入300μl 5%NaNO2溶液，摇匀并且静置6 min，然后加入300μl 10%的Al-Cl3·6H2O溶液，混合后静置6 min，然后加入1 Mol/L的NaOH溶液4m l，混匀。加入75%乙醇溶液定容至25 ml，使标准溶液浓度分别为0、0.008、0.016、0.032、0.040和0.048 mg/ml，然后在510 nm下测定吸光值，空白对照组用纯水作相同处理，重复三次。

1.5 黄酮类化合物的测定

参考刘淑梅等［5］的方法，使用硝酸铝显色法进行黄酮类物质含量的测定。取试样液1.5 m l，加入60μl 5%的NaNO2，摇匀并静置6 min。然后加入60μl 10%的AlCl3·6H2O，混合后静置6 min。加入1 Mol/L的NaOH溶液800μl，最后加入75%乙醇定容至2.5 ml。在510 nm下测定吸光值。对照组用纯水，并做同样处理。

2 结果与分析

2.1芦丁标准曲线

根据实验方法所述，得到如图1所示的标准曲线，回归方程为Y=11.41129X+0.01730，相关系数为r2=0.99401。浓度与对应的吸光度呈良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 Standard Curve of the Rutin

2.2 四种不同茧色家蚕品种五龄不同发育时期的黄酮含量变化

取家蚕绿色、金黄色、白色及红色茧蚕品种各一个，测定其五龄第1～6 d黄酮类含量的变化，结果如图2所示。

从图2可知，各品种的五龄第1～6 d黄酮类化合物含量的变化不尽相同，除绿色茧品种P50外，总体上有随着发育经过先上升后下降的趋势，五龄第1 d的黄酮类含量相对较低，随着发育经过逐日增加，至五龄第3或4 d达到峰值，随后又开始下降。各品种的变化规律也有所不同，其中玉丰的黄酮类含量随着发育经过变化幅度比较大，五龄第1 d相对比其他品种低一些，但高峰值却为最高，随后降至低于第1 d的含量。HHM的变化比较平稳，金秋在五龄早期相对较高，但随后降幅较大，后期为含量最低的品种。绿色茧品种P50幼虫黄酮含量的变化趋势则截然不同，在五龄第1 d时最高，达到0.427 mg，随着发育经过黄酮类含量反而降低，至五龄第4 d最低，随后又开始上升。

2.3 不同家蚕品种五龄第四周天幼虫的黄酮类化合物含量

根据家蚕五龄期的生理生化变化规律，一般认为五龄第3 d是家蚕生理转折期，第4天是处于代谢高峰期，因此取5龄第4 d为测定各品种的时间点，结果如表1所示。

由表1可见，家蚕品种之间血液黄酮类含差异较大，高的明日可达0.347 mg/m l，低的绿秋丰只有0.053 mg/m l，达到6.5倍的差异。将品种按照茧的颜色归类求平均值，其中绿色茧由于P50在前面的测定中发现黄酮类含量较高，所以将含有P50系统的绿茧品种归一类，把其他的绿色茧品种归为一类，结果可见，每类茧中品种之间的黄酮类含量差异也比较大。总体而言，各组的平均值之间没有太显著的差异，只有绿色茧1组的黄酮含量特别低，而这一组的茧色绿色最为鲜艳，绿色2组为含有P50血统的一类绿色茧，其绿色偏黄。分析可能绿色茧1组所具有的基因能把大量的黄酮类化合物运送到丝腺体内，使蚕丝成为自然的绿色，因而导致血液中黄酮类化合物含量反而低，这一推测有待进一步的试验测定来验证。绿色茧2组的各品系由于都含有P50血统，品种间黄酮类的含量差异不大。在白茧组中黄酮类化合物含量品种间的差异比较大，总的趋势是茧丝量高、五龄发育经过长的白茧品种含量相对较高，如表格中较靠前的这些白茧品种；茧层量较低、五龄发育经过相对较短的白茧品种黄酮类含量也相对较低。而在品种的化性和系统之间，并没有明显的变化规律可循，中系品种中有D93A，新苗等高含量的品种，也有银丰、秋丰等低含量的品种，日系品种中也有明日、玉丰等高含量的和ZAU2A、白玉等低含量的品种。但总体来说，在所测定的品种中，较高黄酮含量的品种日系居多。

图2 不同茧色家蚕品种五龄第1～6天黄酮类化合物含量变化趋势Figure 2 Variation of flavonoids contents in larval hemolymph of silkworm Bombyxmori from day 1 to 6 of fifth instar

表1 不同家蚕品种五龄第四天黄酮含量（单位：mg/m l）Table 1 The flavonoids content of silkworm in the fourth day of five age with different varieties

3 讨论

关于五龄不同发育时期黄酮类化合物含量的变化规律，金吉［6］等用秋丰×白玉为材料测定结果认为五龄第3 d达到峰值，随后降低。但本研究用不同茧色的原种进行测定，发现因品种而异，总的趋势是茧丝量相对较低、五龄发育经过较短的品种在五龄第3 d达到峰值，而茧丝量较高、五龄发育经过较长的品种在五龄第4 d达到峰值。这一结果与金吉等的结果也并不矛盾，因为金吉等只测定了一个品种，用的实验材料秋丰×白玉系强健性中丝量杂交种，五龄发育经过相对较短，因此峰值出现在五龄第3 d。

关于绿色茧P50的异常变化规律，作者认为可以从该品种茧色控制基因的遗传差异来解释。在五龄第1 d，其血液中的黄酮类含量比其他品种高，但是由于绿色茧所带有的基因可以将血液中的黄酮类物质运输到丝腺体内，随着五龄的发育经过丝腺体大量合成丝蛋白，生理活性处于活跃期，因此血液中的黄酮类物质也被大量的运输到丝腺体内，而导致血液中黄酮类化合物含量下降，至五龄第4 d达到最低值，随后随着五龄发育后期向成熟方向发展，运输到丝腺体的物质逐渐减少，血液中黄酮的含量就随之增加。这一推测有待进一步的实验来证实。

关于不同品种间血液黄酮类含量的差异，由于五龄4 d并不是所有品种的峰值期，单从这一测定时间在品种间比较黄酮类化合物含量的高低是不可靠的。从本研究结果看，除绿色茧这一特殊的类别以外，似乎与蚕品种的全茧量及发育经过有关，全茧量高、五龄发育经过长的品种，黄酮类含量相对较高，而在品种的系统间似乎没有明显可循的变化规律。金吉等的研究认为五龄幼虫体黄酮类化合物的含量中系高于日系，但本研究的结果显示很多日系品种的黄酮类化合物含量远高于中系品种，这是因为金吉等研究测定时间点在五龄第3 d，而本试验在五龄第4 d。多数日系品种的五龄发育经过比中系长，可能的峰值会出现在五龄第4 d而不是第3 d，所以前者研究结果日系品种的黄酮类含量往往比实际峰值低，而本研究的结果则中系品种的黄酮类化合物含量很可能会比实际峰值低。因此作者认为，对品种间黄酮类化合物含量比较应该测定五龄第3 d和4 d两个时间段为比较合理。

［1］Kang Sun Ryu，Heui San Lee，Sung Hyun Chung，et a1．An activity of lowering blood-glucose levels according to preparative condition of silkworm powder［J］.Korean J Seric Sci，1997，39（1）：79～85.

［2］桂仲争，陈杰，陈伟华，等.全蚕粉（sP）降血糖的作用效果及其机理的研究［J］.蚕业科学，200l，27（2）：114～118.

［3］陈智毅，廖森泰，李清兵，等.多化性黄血蚕的食用和药用价值的研究［J］.蚕业科学，2002，28（2）：173～176.

［4］肖辉，施新琴，罗存敏，等.蚕粉复合物对小鼠若干生理指标的影响［J］.蚕业科学，2004，30（1）：111～114.

［5］刘淑梅，时连根，李有贵.家蚕幼虫体黄酮类化合物的测定方法［J］.蚕业科学，2005，3l（1）：74～78.

［6］金洁，刘淑梅，时连根.家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量的变化规律［J］.2005，31（2）：141～144.

Analysis on Flavonoids Content in Larval Hemolym ph of Silkworm (Bombyxmori)Varieties Conserved in Germplasm Resources

MA Ke,FANG Jun-qing,ZHENG Xiao-m in,CHEN Yu-yin*
（Institute ofApplied Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Flavonoids content in larval hemolymph of four silkworm varieties with different cocoon color from day 1 to day 6 of fifth instar and some other silkworm varieties from germplasm resource were analyzed in the present study.Results showed that peak value of flavonoids appeared in day 3 or 4 depending on the developmental duration and cocoon weight of different silkworm varieties,meanwhile,the silkworm varietieswith green cocoon color showed completely different pattern.There are significant differences of flavonoids contents among silkworm varieties,which is no close relationship with the silkworm races butmight related with their cocoon weightand developmental duration.

Germplasm Resources of Bombyxmori;Cocoon color

S882

：A

：0258-4069［2013］04-021-05

浙江省农业新品种选育重大科技专项（2012C12910）

马可（1991-），男，浙江临安人，本科生，主要从事家蚕生化物质与品种方向的关系研究。E-mail：809417071@qq.com

陈玉银，女，教授。E-mail：chenyy@zju.edu.cn