云烟97巨型变异烟株的组织培养与快速繁殖

何余勇，罗定棋，赵磊峰，张永辉，谢强，年夫照，谢云波，雷晓

1四川省烟草公司泸州市公司技术中心，泸州646000；2 云南农业大学烟草学院，昆明650201

烟草（NicotianatabacumLinn.）是我国重要经济作物之一，有效叶数是影响烟叶经济产量的重要因素[1]。烟草一般采用有性繁殖，杂交育种技术繁琐且受自然条件限制较多，不能较好地克服品种自然退化的问题，甚至出现大面积的苗床带毒苗流入生产，造成严重的经济损失[2-3]。烤烟品种具有很强的区域适应性，在自然选择作用下偶尔会形成巨型变异株系，显著特点是有效叶数多、开花结实晚或者困难，这在我国烟区均有报道[1,4-5]，是烤烟遗传育种和推广应用的重要来源。2006年，在云南昆明发现一株“红花大金元”巨型变异株，后经系统选育形成烤烟YK01品系，变异株系适应性较广、农艺性状可调控阈值大、产量产值高、烟叶品质良好、可用性强，多项指标已近似或超过其亲本红花大金元，对有效利用土地具有重要意义[6]，在感官质量评吸上，变异品系与常规“红花大金元”风格特征接近。

巨型变异株具有叶数多、品质优等综合表现，但在中高海拔烟区开花结实困难，给遗传资源的保存与开发带来阻碍，组织培养技术兴起较好地解决了“变异烟株结实困难”问题。目前，关于烤烟组织培养的报道不断增多[7-10]，为保持变异烟株的优良性状，加快优良品系的开发提供了技术支撑，从而达到选育高产抗病优质新品种目的[5]。但既有报道关于烤烟变异烟株组织培养的报道不多，特别是关于烤烟变异烟株组织培养过程以及激素配比等还需进一步探索。2011年，在四川泸州发现一株云烟97巨型变异烟株，有效叶片60余片并未开花结实，烟叶烤后多为桔色，原烟外观质量、经济价值与云烟97接近。为保存优良遗传资源和加快变异品系应用，本研究以云烟97该巨型变异株系为材料，采用组织培养技术获得了再生组培苗，通过研究不同激素、激素的不同浓度对再生苗的影响，筛选出云烟97变异烟株快速繁殖的培养基配方，并对植物激素的种类、浓度、配比等进行了详细研究，对外植体切块时间和植物激素添加时间进行了探讨，进一步丰富了中高海拔地区巨型变异烟株组培快繁体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云烟97变异烟株来源于泸州古蔺向阳烟叶基地（图1），取烟杈嫩叶作为外植体。

图1 云烟97巨型变异烟株田间长势

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试 验 采 取 诱 导 培 养 基 1（6-BA2 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1）诱导愈伤组织；诱导培养基2分 别 设 MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.1mg·L-1、MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1、MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.3mg·L-1三个浓度配方，分析NAA对不定芽增殖的影响；诱导培养基3设1/2MS+6-BA 0.20 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1、1/2MS+6-BA 0.10 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1、1/2MS+6-BA 0.05 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1三个浓度配方，以不添加激素为对照，分析6-BA浓度对根诱导的影响。在愈伤组织形成芽点10 d、15 d、20 d和25 d外植体切块，分析不同切块时间对丛芽增殖的影响；设置灭菌前加激素、灭菌后加激素两个处理，以不加植物激素为对照，探索激素加入方式对不定芽增殖的影响。所用培养基pH均为5.8，12h光照，26℃±1℃条件培养。

1.2.2 炼苗和移栽

无根幼苗约10 d后长出新根，生根培养20 d后将组培瓶盖打开，继续放置在培养箱中，2 d后移到与培养温度相同的温室中炼苗，使嫩苗逐渐与外界接触，注意保持较高的空气湿度。炼苗7 d后，用镊子把苗从培养瓶中取出，用流水将根部的培养基冲洗干净，然后移入已消毒的基质中漂浮培养，注意及时喷水保持湿度，20 d后移栽入土。

1.2.3 统计方法

试验中，设置愈伤组织不同切块时间、不同激素浓度配比、不同的激素加入方式等对组培效率的影响，观察记录变异烟株组织培养过程变化情况，利用Excel2007、SPSS对试验相关数据进行统计分析，按照以下公式进行：

2 结果与分析

2.1 愈伤组织形成与再分化成苗的过程观察

外植体转接在诱导培养基1后约2～3 d，开始卷曲、增厚、膨胀，之后变成圆拱形，5～7 d后外植体表面积增大50%～70%，叶片颜色变深（图2-A）；继续培养至12～14 d，外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的半透明愈伤组织（图2-B）；继续在培养基1上培养至6-7 d，可见大量的2-4 mm的丛生芽（图2-C）形成，此时转接到培养基2上诱导芽的增殖和再生芽的分化（图2-D）；20-25 d后，再生芽分化形成可见的小苗（图2- E、F）；将可见的小苗逐一切下，转接到培养基3上诱导根系分化，约15-20 d后，形成明显可见的主根系，并逐渐分化出侧根系再生烟株（图2- G）；炼苗7-10 d后，将生根的组培苗移栽至烤烟育苗基质上，7-10 d后即可还苗（图2-H）。

图2 云烟97巨型变异烟株组织培养与快速繁殖过程

2.2 愈伤组织的切块时间对外植体丛芽增殖的影响

分别于10 d、15 d、20 d和25 d将外植体切块，分析不同切块时间对丛芽增殖的影响。从图3和图4可以看出，10 d的切块效果较差，丛芽增殖效率较低，增殖倍数仅为1.82，有效芽数和分化成芽率为3.15%（图4-A）；15 d、20 d切块外植体丛生芽增殖效果较好，褐变数量较少，增殖倍数分别达到2.94和2.78，分化成芽率分别为35.16%、34.00%（图4-B、C）；25d切块的效果稍差，外植体褐变数量最大，褐变率较高，有效芽数和分化成芽率也低于15 d、20 d处理（图4-D、E）。

图 3 愈伤组织的切块时间对外植体分化成芽率和增殖倍数的影响

这说明切块时间太早，愈伤组织尚未形成一定数量的小芽，芽点数较少，增殖倍数自然较低；15 d、20 d的切块处理，愈伤组织芽数较适宜，增殖效果较好，分化成芽率较高；随着时间的继续推迟，愈伤组织上的芽点数增多，但由于丛芽的群体效应，有效芽形成率减少，且由于愈伤组织诱导时间过长，在转入培养基2后，容易出现褐变，从而也影响有效再生芽的成活。

图 4 愈伤组织不同切块时间对不定芽增殖的影响

2.3 NAA浓度对愈伤组织不定芽增殖的影响

分析不同NAA浓度与6-BA的互作，以及对愈伤组织不定芽增殖效果的影响。表3结果表明，当6-BA浓度为2 mg·L-1时，以NAA浓度为0.2 mg·L-1时，分化成芽率最高为51.46%，其次为NAA浓度0.1 mg·L-1的40.18%，最低为NAA浓度0.3mg·L的36.96%。

表 1 NAA浓度对愈伤组织不定芽增殖的影响（mg·L-1、块、%）

当6-BA与NAA比值增大，不定芽数和芽丛数先增加后减少，以NAA 0.2 mg·L-1为最佳浓度。随着NAA浓度降低，有效芽数量降低；随着NAA浓度提高，不定芽和丛芽数均降低，这说明，增加NAA浓度会削弱6-BA的细胞分裂作用，适量浓度的NAA可以获得更多的有效芽，提供更多的有效芽来诱导形成小苗。

2.4 激素的加入方式对不定芽增殖的影响

植物激素高温灭菌一般都是不能的，都会有损失，与培养基一起灭菌操作简单、方便，但具体损失百分数不定，试验设置灭菌前加激素、灭菌后加激素两个处理，以不加植物激素为对照（图5）。不定芽增殖培养基均为 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，结果表明，两种激素加入方式条件下，有效芽数和分化成芽率差异不显著，分别为29、30块和46.03%、46.88%，不加植物激素的CK却不能形成有效芽，分化成芽率为15.00%，不定芽增殖的效率明显低于两个处理。这说明，一次性高压湿热灭菌，对6-BA和NAA的破坏程度较低，基本不影响对不定芽增殖，不过，要注意灭菌次数对培养基营养的影响。

图 5 6-BA和NAA的加入时间对不定芽、有效芽形成与分化成芽率的影响

2.5 6-BA浓度对根诱导的影响

将2-3cm高的组培苗接种到1/2 MS培养基上，并加入不同浓度的6-BA和IBA，15 d后观察结果（表2）。结果表明，加入激素的各处理均能诱导组培苗长根，且根系较发达，未加入激素的对照，仅仅诱导1条根系，且细小、生命力弱且生根率低，当6-BA 0.10 mg·L-1和 IBA 0.5mg·L-1配比时，生根总数、生根率和平均长度数值最大，其次为6-BA 0.05 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1配比，二者无显著差异；当6-BA 0.20 mg·L-1和 IBA 0.5 mg·L-1配比时，生根总数、生根率与平均长度均低于前两者，且呈显著差异。

表 2 不同的6-BA浓度对根系诱导的影响（mg·L-1、株、%）

3 讨论

3.1 外植体消毒时间对消毒效果的影响

外植体大部分取自田间，表面上附着了大量病原微生物，消毒是组织培养一大障碍，组养前须进行消毒处理，把材料表面上的各种微生物杀灭，又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长，所以消毒时间长短对外植体的消毒效果十分关键。本试验采用为10%的过氧化氢溶液，如果时间过长，就容易出现外植体坏死等问题，当消毒时间达8 min，可见外植体边缘，特别是手术刀切割处变为深褐色，如果继续延长时间，坏死范围不断扩大，影响外植体形成愈伤组织，以及愈伤组织分化形成丛芽的效率，所以在试验过程中，要根据外植体自身情况，选择合理的消毒时间。

3.2 组织培养中植物激素的配比与浓度配比

常用的植物激素有吲哚乙酸(IAA) 、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和激动素(KT)， 其中诱导细胞分裂的有6-BA和KT，诱导细胞分化的有NAA、IAA和IBA，各激素的作用原理基本一致，作用效率也因对象而不同。本研究中，采用的是6-BA、NAA和IBA三种植物激素，分别探讨了NAA浓度对芽的分化的影响，6-BA对根系分化的影响，并对愈伤组织不同切块时间，以及植物激素加入方式等进行了研究。结果发现，当6-BA浓度为2 mg·L-1时，NAA 0.2 mg·L-1的处理对丛生芽的增殖和再生芽的诱导作用方面要优于NAA 0.1 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1，这与谢庆华的 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1结果一致[3]；当 IBA 浓度为 0.5 mg·L-1时，6-BA 0.10 mg·L-1对根系诱导的效果优于 6-BA 0.05 mg·L-1、6-BA 0.20 mg·L-1。关于植物激素的浓度，许多研究使用了不同的浓度，却能达到理想的效果，如朱生伟、徐仲等[11]研究中，诱导愈伤组织形成丛生芽的培养基配方为 2/3MS+BA0.5mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1，诱导根的培养基配方为 2/3MS+BA0.1mg·L-1+NAA1 mg·L-1；施和平、黄群声等[8]采用的幼芽增殖培养基配方为MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1，生根培养基配方为MS +NAA0.2 mg·L-1。这说明，植物激素的作用不仅仅为单方面作用的，而是表现在激素间的互作，在实践过程中，需要进行不断的尝试，以取得最佳的试验效果。

3.3 切块时间与激素加入方式对组培效率的影响

关于烤烟组织培养的切块时间和激素加入方式对组织培养效率的研究，至今鲜见报道，本研究弥补了研究的空白。在外植体丛生芽增殖阶段，切块时间的早晚，直接影响丛生芽的增殖，并与外植体褐变、污染等有一定关联。本研究中，分别在丛芽形成后的10 d、15 d、20 d和25 d对外植体切块，结果发现，切块时间过早，丛芽增殖效率较低，有效芽数和分化成芽率较低；切块时间过晚，体褐变数量最大，褐变率较高，有效芽数和分化成芽率也开始降低。研究结果发现，以15 d、20 d切块外植体丛生芽增殖效果较好，褐变数量较少，增殖倍数理想，易于分割。同时，研究表明，一次性高压湿热灭菌，对6-BA和NAA活性影响不大，基本不影响不定芽增殖，但要注意灭菌次数对培养基营养的影响。

4 结论

外植体采用10%的过氧化氢溶液消毒时，消毒时间不应超过8 min，具体应根据外植体自身情况，选择合理的消毒时间。

最佳愈伤组织诱导和不定芽分化的培养基配方为MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，最佳生根培养基配方为 1/2MS+6-BA 0.10 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1。

丛芽形成后15 d、20 d切块外植体丛生芽增殖效果较好，褐变数量较少，增殖倍数理想，易于分割。

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