山东地区汉族人群15个X-STR基因座的遗传多态性

马腾，徐婧，杨亚军，孙宽，薛付忠，金力，李士林

（1.复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室，上海 200433；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；3.山东大学公共卫生学院，山东济南 250012）

·技术与应用·

山东地区汉族人群15个X-STR基因座的遗传多态性

马腾1，徐婧1，杨亚军1，孙宽2，薛付忠3，金力1，李士林1

（1.复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室，上海 200433；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；3.山东大学公共卫生学院，山东济南 250012）

目的研究山东地区汉族人群15个X-STR基因座的遗传多态性，建立法医学应用数据库。方法采用Primer Premier 5.0软件设计多重PCR引物，用4色荧光（FAM、VIC、NED、TET）进行标记，建立多重PCR体系，对山东地区无关汉族人群481例个体（女性295例，男性186例）的15个X染色体上筛选的STR基因座（DXS10011、DXS101、GATA165B12、DXS6795、DXS6800、DXS6801、DXS6803、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8377、DXS8378、DXS9898和HPRTB）进行检测。结果所检测的15个X-STR基因座中，GATA165B12、DXS6800、DXS6803、DXS7133与DXS7423在中国山东汉族人群中具有中度多态性，其余10个基因座都具有高度多态性（PIC＞0.5，H＞0.5）。群体中男性样本之间没有检测到共享单倍型。结论构建的荧光标记复合扩增体系为建立中国山东汉族人群X-STR基因座群体遗传学数据库及其法医学应用提供了有效的手段。

法医遗传学；多态现象，遗传；X-STR；山东；汉族

由于人类X染色体独特的遗传性质[1]，X染色体短串联重复序列（X-short tandem repeats，X-STR）在复杂亲缘关系（祖母-孙女，同父异母的姐-妹）鉴定中具有常染色体、Y染色体及线粒体不可比拟的优势[2-6]。但是对于这类特殊亲缘鉴定案件，当前国内外尚缺乏成熟的X-STR试剂盒，限制其研发的一个主要因素是缺乏足够的群体遗传学数据以有效地评价X-STR基因座的法医学参数。本研究在154 Mb的X染色体上，依据X-STR遗传标记的多态信息含量、连锁状态等信息，筛选出在中国人群中具有多态性、相互之间不连锁、适合中国人群的15个X-STR基因座，建立一个多重复合荧光扩增体系，对中国山东地区汉族人群进行遗传学调查，建立相应X-STR基因座群体遗传学数据库，为特殊亲缘关系案件的鉴定积累资料。

1 材料与方法

1.1 DNA样本制备

在知情同意原则下，采集481例（女性295例，男性186例）中国山东地区汉族无关个体血样。所有血样都采取EDTA抗凝处理，用Chelex-100法提取DNA[7]。

1.2 试剂与仪器

引物合成及荧光标记均由上海基康生物技术有限公司合成。PCR反应缓冲液由本实验室自制。NanoDrop®ND-1000微量紫外可见分光光度计购于美国Thermo Fisher Scientific公司。2720型、9700型PCR扩增仪，3130XL遗传分析仪，POP7胶，对照品DNA（Control DNA 9947A），LIZ500和去离子甲酰胺都购于美国AB公司。

1.3 引物

在154Mb的X染色体上，依据X-STR遗传标记的多态信息含量、连锁状态等信息，筛选出在中国人群中具有多态性，且相互之间不连锁的15个X-STR遗传标记，使用Primer Premier 5.0软件设计多重PCR引物，用4色荧光（FAM、VIC、NED、TET）标记，最后构建了多重复合荧光PCR扩增体系，15个X-STR基因座信息详见表1，其中UniSTS数据库信息来源于NCBI[8]，染色体位置和物理位置信息来源于ChrXSTR.org 2.0[9]。

表1 15个X-STR基因座的引物序列

1.4 多重PCR扩增

多重PCR体系的体积为10 μL，包括模板DNA 2μL（1～5ng）、10×PCR缓冲液1μL、25mmol/L MgCl20.5 μL（终浓度为1.5 mmol/L）、引物混合液1 μL（终浓度为0.06～0.15 μmol/L）、2 mmol/L dNTPs 1.5 μL（终浓度为300 μmol/L）、5 U/μL金牌Taq酶0.2 μL（即1.25U），纯水补充到10μL。

多重PCR扩增条件：95℃15 min；94℃1 min，60℃1min，72℃1min，30个循环；60℃延伸60min。多重PCR扩增结束后，取PCR产物1 μL，加至9 μL上样液［V（去离子甲酞胺）∶V（LIZ500）=24∶1］中，95℃变性3min，冰浴3min。3130XL型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分析，采用GeneMapper v3.2软件分析扩增产物的基因型。

1.5 统计学分析

采用Arlequin 3.0[10]和PowerStats v12软件分别计算等位基因频率、基因多样性，以及各种群体遗传学参数[11-12]：各个基因座的杂合度（H）、在女性群体的个体识别率（DPF）、在男性群体的个体识别率（DPM）、多态信息含量（PIC）以及非父排除率（PE）。

2 结果

2.1 多重PCR体系

经Control DNA 9947A分型，且反复测试，结果未见明显变化，确认复合荧光PCR灵敏度高，结果重复效果好，结果见图1。15个X-STR基因座在481例山东汉族无关个体中获得了准确的基因分型结果。

2.2 15个X-STR基因座在山东汉族群体中的多态性

15个X-STR基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。15个X-STR基因座在山东汉族群体的各个基因座等位基因频率分布见表2，各个基因座的群体遗传学参数见表3。

在186名山东汉族男性无关个体中没有检测到共享的单倍型。

图1 Control DNA 9947A分型结果

表2 中国山东汉族群体15个X-STR基因座等位基因频率

续表2

表3 15个X-STR基因座在山东汉族群体的群体遗传学参数

3 讨论

本研究所选择的15个X-STR基因座为三核苷酸重复（DXS6795、DXS101、DXS7424和DXS8377），四核苷酸重复（DXS10011、GATA165B12、DXS6800、DXS6801、DXS6803、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS8378、DXS9898和HPRTB）。采用多重复合荧光PCR同时扩增15个X-STR基因座，方法快速、方便、准确。经过Control DNA 9947A的反复测试，结果未见明显变化，确认多重复合荧光PCR同时兼具高灵敏度和可重复性。通过中国山东汉族人群遗传多态性分析发现，15个X-STR基因座中，GATA165B12、DXS6800、DXS6803、DXS7133与DXS7423在山东汉族人群中具有中度多态性，其余10个基因座都具有高度多态性（PIC＞0.5，H＞0.5）。由于人类X染色体的遗传特性，X-STR在复杂亲缘关系（祖母-孙女、同父异母的姐-妹）鉴定中具有其他染色体不可比拟的优势。但是这类复杂亲缘案都有一个共性，必然存在一条X染色体在即待检样本（祖母-孙女、同父异母姐-妹）之间作遗传载体，而这条X染色体由男性个体携带。正常男性个体只有一条X染色体，不同X-STR基因座之间组成单倍型。因此对于祖母-孙女、同父异母姐-妹等特殊的亲缘鉴定案，男性群体中X-STR单倍型频率是评估一组X-STR单倍型是否适用的重要群体遗传学参数。本研究中，15个X-STR基因座在186例山东汉族男性群体中没有发现单倍型共享现象，显示该扩增体系在山东人群中具有高度分辨率，是一组理想的X-STR遗传标记，能为疑难亲缘鉴定案件的鉴定提供有效的手段，在法医学鉴定中有较高的应用价值。

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[8]NCBI[DB/OL].[2012-12-12].http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez.

[9]ChrX-STR.org 2.0[DB/OL].[2012-12-18].http://www. chrx-str.org/.

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Genetic Polymorphisms of 15 X-STR Loci in Shandong Han Population

MA Teng1,XU Jing1,YANG Ya-jun1,SUN Kuan2,XUE Fu-zhong3,JIN Li1,LI Shi-lin1
（1.Ministry of Education Key Laboratory of Contemporary Anthropology,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China;3.School of Public Health,Shandong University,Jinan 250012,China）

ObjectiveTo investigate the genetic polymorphisms of 15 X-STR loci in Shandong Han population in order to establish the forensic application database.MethodsThe multi-PCR primers of these loci were designed by Primer Premier 5.0 software and labeled by 4 fluoresceins（FAM,VIC,NED and TET）. The developed multi-PCR was used to investigate 15 X-STR loci（DXS10011,DXS101,GATA165B12, DXS6795,DXS6800,DXS6801,DXS6803,DXS7132,DXS7133,DXS7423,DXS7424,DXS8377,DXS8378, DXS9898 and HPRTB）selected from the X chromosome of 481 unrelated individuals（295 females and 186 males）in Shandong Han population.ResultsAmong the 15 X-STR loci,GATA165B12,DXS6800, DXS6803,DXS7133 and DXS7423 showed moderate polymorphisms,while the rest 10 X-STR loci showed high polymorphisms（PIC＞0.5 and H＞0.5）.No shared haplotype was detected among the males in Shandong Han population.ConclusionThe developed multi-PCR system with fluorescence detection provides an effective way to establish X-STR loci database of population genetics in Shandong Han population and shows its forensic application.

forensic genetics;polymorphism,genetic;X-STR;Shandong;Han nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.012

1004-5619（2013）03-0202-04

2013-04-01）

（本文编辑：李成涛）

国家高技术研究发展计划（863计划）（SS2012AA02 1303）；国家自然科学基金面上项目（31071096）

马腾（1984—），男，内蒙古乌兰察布人，硕士，主要从事法医人类学研究；E-mail：mt152630@163.com

李士林，男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事法医人类学、群体遗传学研究；E-mail：lishilin0413@gmail.com