响应面法优化胡桃楸种仁壳总黄酮微波提取工艺

徐红艳，包怡红*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

响应面法优化胡桃楸种仁壳总黄酮微波提取工艺

徐红艳1,2，包怡红1,*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

以胡桃楸种仁壳为原料，研究微波提取其总黄酮的最佳提取工艺条件。以总黄酮得率和总还原力为指标，进行单因素试验，并在此基础上，选取乙醇体积分数、料液比、微波功率和微波时间为独立变量，采用响应面法进行优化并得到回归模型。结果表明：各变量影响主次顺序为料液比＞乙醇体积分数＞微波功率＞微波时间；经过优化后的提取工艺参数为：乙醇体积分数55%、料液比1:34(g/mL)、微波功率640W、微波时间13min，通过验证实验总黄酮得率为9.59mg/g，RSD为1.98%，该回归方程与实际情况拟合较好。提取液在7h内总黄酮含量和总还原力基本保持稳定。

胡桃楸；种仁壳；总黄酮；微波法；响应面法

胡桃楸(Juglans mandshurica)系温带树种，又名山核桃、楸树，属落叶乔木[1]，是古老而又重要的经济型树种之一，其种仁营养价值高，富含蛋白质、氨基酸和不饱和脂肪酸[2]；木材优良，材质坚硬致密，被广泛用于军工、建筑、乐器制造等方面[3]。胡桃楸药用价值较高，研究表明，其根、叶、树皮及青果皮等提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛等多种药理作用[4]，相关的化学成分研究也较为深入[5]，但关于种仁壳活性成分的具体研究还鲜见报道。黄酮类化合物是在植物中分布广泛的天然产物，研究显示具有多种药理活性[6-7]，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等，早已引起学者的广泛关注[8-9]。响应曲面法(response surface methodology，RSM)是通过多元二次回归方程来拟合自变量因素与响应值之间的函数关系，并利用软件进行统计分析试验结果，从而优化工艺参数的方法。目前已得到广泛应用[10-11]。

胡桃楸种子作为林业副产品，在种仁加工过程中，产生大量的种仁壳废弃物，目前极少部分的种仁壳被加工成工艺品，多数做烧材。本实验以胡桃楸种仁壳为原料，采用微波法提取总黄酮，通过单因素和响应面试验优化其提取工艺，旨在为胡桃楸种仁壳的综合开发利用及其活性成分的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

胡桃楸种子由黑龙江省牡丹江地区林业局提供。

芦丁标准品 中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；WD800(MG-5531SD)微波炉 乐金电子(天津)电器有限公司；R-201旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，按Huang Wuyang等[12]方法略有改动。准确称取芦丁标准品5.0mg，用体积分数60%乙醇定容50mL，配制质量浓度为0.10mg/mL的芦丁标准溶液。精确移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的芦丁标准溶液于10mL容量瓶中，分别用体积分数60%乙醇补至3mL，再分别向各容量瓶中加5%的NaNO2溶液0.4mL，摇匀，静置6min；加10%的Al(NO3)3溶液0.4mL，摇匀，静置6min；最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，定容至刻度，放置20min，在510nm波长处测定其吸光度，以芦丁质量浓度X(mg/mL)为横坐标、以吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线回归方程为Y=13.536X－0.0005，相关系数R2=0.9994。

1.2.2 总黄酮提取及得率测定

胡桃楸种仁壳粉碎，过60目筛。准确称取2.5g种仁壳粉，按照实验设定条件下的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，密封后室温浸泡30min，进行微波提取，再于55℃水浴30min，然后将提取液真空抽滤、减压浓缩并定容至50mL。取1mL提取液，按标准曲线方法测定总黄酮质量浓度，按公式[13]计算得率：

1.2.3 Fe3＋总还原力的测定

按Wong等[14]采用铁氰化钾还原法并略有改动。向试管中加入提取液2mL，再分别加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL、1%铁氰化钾2.5mL，混匀后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混匀并离心10min(4000r/min)。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水，再加入0.5mL三氯化铁显色，静置10min，700nm波长处测定其吸光度A1，以蒸馏水代替提取液为A0，Fe3＋总还原力=A1－A0，A1－A0越大说明Fe3＋总还原力越强。

1.2.4 单因素试验

以微波功率、微波时间、乙醇体积分数、料液比为单因素，考察各单因素对胡桃楸种仁壳总黄酮得率和Fe3＋总还原力的影响。

1.2.5 响应面法优化试验设计

通过Minitab 15软件，根据Box-Behnken试验设计原理[15]，采用四因素三水平响应面分析法，以乙醇体积分数、料液比、微波功率和微波时间4个因素为独立变量，以总黄酮得率为响应值。具体设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平编码Table1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.2.6 验证实验及稳定性实验

按响应面优化的工艺条件，提取胡桃楸种仁壳总黄酮，进行3次平行实验，考察响应面法优化工艺条件的重复性。

对制备的总黄酮提取液，每隔1h测总黄酮含量及总还原力，测定7次，考察提取液的稳定性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对总黄酮得率和总还原力的影响

图1 微波功率对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.1 Effect of microwave output power on total flavonoid yield and total reducing power

在乙醇体积分数60%、料液比1:30、微波时间15min的条件下，微波功率对总黄酮得率和总还原力的影响，结果如图1所示，当微波功率在160～640W时，随着微波功率的增大，微波的作用逐渐加强，总黄酮得率和总还原力都逐渐增加，当微波功率达640W时，达到最大，之后呈下降趋势，可能是由于较大微波功率使种仁壳中的某些黄酮类成分遭到破坏，从而导致黄酮得率和总还原力有所下降。因此最佳微波功率为640W。

2.1.2 微波时间对总黄酮得率和总还原力的影响

图2 微波时间对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.2 Effect of microwave irradiation time on total flavonoid yield and total reducing power

设定微波功率640W，其他条件同2.1.1节，微波时间对总黄酮得率和总还原力的影响如图2所示，随着微波作用时间的延长，总黄酮得率缓慢增加，总还原力增加辐度大；当微波时间为12min时，达最大值；之后随着微波时间的延长，总黄酮得率和总还原力都逐渐下降，可能是由于微波所产生的热量长时间作用于种仁壳，从而破坏了某些热敏性黄酮类成分。因此最佳微波时间为12min。

2.1.3 乙醇体积分数对总黄酮得率和总还原力的影响

图3 乙醇体积分数对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on total flavonoid yield and total reducing power

设定微波时间12min、其他条件同2.1.2节，乙醇体积分数对总黄酮得率和总还原力的影响如图3所示，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率和总还原力增加；当乙醇体积分数为50%时，总黄酮得率和总还原力达最大；之后都逐渐下降，主要是由于高体积分数乙醇更适合提取苷元类成分，而植物中的黄酮类物质多是以黄酮苷的形成存在。因此选取最佳乙醇体积分数为50%。

2.1.4 料液比对总黄酮得率和总还原力的影响

图4 料液比对总黄酮得率和总还原力的影响Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on total flavonoid yield and total reducing power

设定乙醇体积分数50%，其他条件同2.1.3节，料液比对总黄酮得率和总还原力的影响如图4所示，当料液比在1:10～1:30时，总黄酮得率和总还原力都大辐度增加，这是因为提取液用量增加，传质动力增加；之后随着提取液用量的增大，总黄酮得率和总还原力增加趋于缓慢。因此考虑经济效益，最佳料液比为1:30。

2.2 响应面法优化种仁壳总黄酮提取工艺

表2 响应面试验设计方案及结果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 响应面分析优化后模型的系数检验Table3 Coefficients and their significance in the response surface equation

表4 响应面优化回归方程的方差分析Table4 Analysis of variance for the response surface equation

根据表2进行试验，对试验结果回归拟合所得回归模型如下：

由表3可知，相关系数R2=91.58%，线性项X2对黄酮得率影响极显著(P≤0.01)，X1、X3和X4对黄酮得率影响显著(P≤0.05)；平方项对黄酮得率影响均极显著(P≤0.01)；但交互项X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4对黄酮得率影响均不显著(P＞0.05)。采用方差分析，分析回归模型的显著性及适应性，结果见表4，响应面回归模型极显著(P≤0.01)；模型失拟项P=0.202，不显著(P＞0.05)，说明该二次模型可以较好地描述各变量与响应值之间的关系，能够拟合真实的试验结果。

综合分析响应面试验结果可知，料液比对黄酮得率的影响最大，次之是乙醇体积分数和微波功率，微波时间影响较小。依据回归模型确定最佳工艺参数为：乙醇体积分数55.21%、料液比1:33.6、微波功率679.07W、微波时间12.7min。回归模型预测的黄酮得率理论值为9.74mg/g。

2.3 验证实验

为检验Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，将上述优化出的工艺参数修正为：乙醇体积分数55%、料液比1:34、微波功率640W、微波时间13min。以最佳工艺参数做3次平行实验，黄酮得率分别为9.59、9.63mg/g和9.54mg/g，平均得率为9.59mg/g，与理论预测值9.74mg/g相比，相对标准偏差为1.98%，可见该模型能较好地模拟和预测微波辅助提取胡桃楸种仁壳黄酮的提取效果。

2.4 稳定性实验

表5 稳定性实验结果Table5 Results of stability experiments

提取液室温常规放置，稳定性实验结果见表5。在7h内，总黄酮得率和总还原力变化差异不大，相对标准偏差(RSD)分别为0.52%和0.64%，表明提取液在7h内基本保持稳定。

3 结 论

本研究以响应面法优化胡桃楸种仁壳总黄酮微波提取工艺，各因素对总黄酮提取效果影响的主次顺序是：料液比＞乙醇体积分数＞微波功率＞微波时间；经过优化后的提取工艺条件为：乙醇体积分数55%、料液比1:34、微波功率640W、微波时间13min，通过验证实验总黄酮得率为9.59mg/g，与预测值之间的相对标准偏差较小，证明响应面法得到的胡桃楸种仁壳总黄酮提取条件是真实可靠的。经稳定性实验，表明提取样液在7h内总黄酮含量和总还原力基本保持稳定。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Flavonoids from Seed Shell of Juglans mandshurica Using Response Surface Methodology

XU Hong-yan1,2，BAO Yi-hong1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Agricultural College, Yanbian University, Yanji 133000, China)

The objective of this study was to establish the optimal conditions for microwave-assisted extraction of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica. The extraction yield and total reducing power of total flavonoids were investigated as a function of independent variables including ethanol concentration, solid-to-liquid ratio, microwave output power and irradiation time by fitting a regression model. These variables were ranked in decreasing order of importance as solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, microwave output power and irradiation time. The optimized extraction conditions were found to be 55% ethanol as the extraction solvent with a solid-to-liquid ratio of 1:34 (g/mL) and microwave irradiation for 13 min with an output power of 640 W. The average extraction yield of total flavonoids obtained from validation experiments was 9.59 mg/g with RSD of 1.98% (n = 3), and the experimental data could be fitted with the developed regression model very well. Within 7 h, the total flavonoid content and total reducing power of the extract obtained remained substantially.

Juglans mandshurica；seed shell；total flavonoids；microwave-assisted extraction；response surface methodology

TS255.1

A

1002-6630(2013)18-0032-04

10.7506/spkx1002-6630-201318007

2012-07-06

中央高校基本科研业务费专项(LD09C14)

徐红艳(1975—)，女，讲师，博士研究生，主要从事天然产物转化与功能性食品研究。E-mail：hongyanxu122628@163.com

*通信作者：包怡红(1970—)，女，教授，博士，主要从事天然产物转化与功能性食品研究。E-mail：baoyihong@163.com