复方金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤及细胞周期的影响

陈兴田 陈广通 汪冬庚 黄金华

[摘要]目的观察复方金蟾胶囊对小鼠移植性肝癌HepA腹水瘤的抑制作用。方法将50只BALB/C小鼠随机分为模型组、对照组（环磷酰胺，CTX）、金蟾小剂量组、金蟾中剂量组和金蟾大剂量组，每组10只。采用移植性HepA肝癌腹水瘤模型，进行抑制肿瘤的实验；给药结束第3天，摘取小鼠肿瘤组织和胸腺组织计算抑瘤率和胸腺指数，用流式细胞仪观察肿瘤细胞周期及细胞凋亡情况；取血测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。结果与模型组比较，金蟾各剂量组均可以增加小鼠胸腺重量及胸腺指数（P<0.01），明显抑制肿瘤生长；与模型组比较，对照组的肿瘤细胞仅G2/M期比例增加（P<0.05），金蟾小剂量组仅S期细胞比例增高（P<0.05）；金蟾大剂量组G2/M期、S期细胞比例均高于模型组。结论复方金蟾胶囊对小鼠移植性HepA肝癌腹水瘤具有明显抑制作用。

[关键词]肝癌；BALB/C小鼠；环磷酰胺；金蟾胶囊

[中图分类号]R735.7 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2012）12（a）-0012-03

随着工业化的进展的加速，各种污染就随之而来，癌症的发生率也逐步上升。在长江和黄海的交界的启海农村，肝癌成为最常见的恶性肿瘤。为此，国家专门设立江苏省启东肝癌研究所，以研究肝癌的起因、预防和治疗。目前治疗肝癌的方法很多，效果均不明显，尤其是晚期肝癌，生存期很难延长。开发传统中草药用来抗癌是当今肿瘤防治的趋势之一。蟾蜍是指两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍，多产于江浙一带，以蟾蜍为来源的中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾，主要药用作用有强心、解毒、止痛、增强免疫等。其本身就有一定毒性，食用过量会导致死亡。所以，古代中医就有“以毒攻毒”的说法，用它来治疗恶性疾病。目前发现蟾蜍具有一定抗肿瘤的作用，启东肝癌研究所生产的复方蟾龙片，海门的蟾衣研究所生产的蟾衣制品，均为开发的蟾蜍产品，在临床抗肝癌治疗中，都取得了一定的效果。金蟾胶囊是本院自行开发研制，以中华大蟾蜍的新鲜蟾皮为主药，配以其他十几味珍贵中药精制而成的中药复方制剂。本研究复制肝癌模型，施以金蟾胶囊治疗，观察验证其抗肿瘤作用并探讨其作用机制，为该复方中药的临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料

BALB/C小鼠50只，均为雄性，体重20～25g，由南通大学医学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK（苏）2002—0022。瘤株采用HepA肝癌腹水瘤小白鼠，种鼠由中国科学院上海药物研究所提供。

1.2仪器与试药

1.2.1仪器 流式细胞仪：美国guavaeasyCyte8系统；分析天平：梅特勒-托利多-30型；净化台：苏州净化设备公司SW-CJ-2F型。

1.2.2试药 金蟾胶囊：每粒含中药0.25g，由南通大学药学院加工制备，批号：20110408；实验前将胶囊内容物用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液调配成3种不同浓度的混悬液，备用。环磷酰胺（CTX）：无锡恒瑞制药股份有限公司生产，批号：110211，实验时用注射用蒸馏水溶解配制。

1.3方法

取出HepA肝癌腹水瘤小白鼠的腹水瘤，捣碎成溶液。吸取0.2mL用16号针尖腹腔接种到BALB/C小鼠的腹内，一共接种50只，第2天称重，随机分为5组。（1）模型对照组：10只小鼠，用0.5%CMC溶液灌胃，剂量为1mL/100g小白鼠体重；（2）阳性对照组：10只小鼠，腹腔注射CTX，剂量为2mg/100g体重；（3）金蟾小剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为40mg/100g体重；（4）金蟾中剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为80mg/100g体重；（5）金蟾大剂量组：10只小鼠，用复方金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为120mg/100g。各组按照上述要求给药，每天1次，连续10d，到第11天处死。

1.4观察指标

1.4.1抑瘤率和胸腺指数 剥离皮下瘤块，用滤纸吸干净后称重，计算各组抑瘤率和胸腺指数。计算公式为胸腺指数=[胸腺质量（mg）/小鼠质量（g）]×10。抑瘤率=（对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重[1-2]。

1.4.2小鼠TNF-a浓度测定 在实验到第11天小鼠处死前，各组采用眼球摘取法取血1mL，放置于冰箱0℃保存，24h后，于1500r/min离15min，取上清液，用波长450nm酶联仪依序测量光密度（OD值）后换算血清中TNF-α浓度[3-4]。

1.4.3金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤细胞周期测定 各组小鼠处死后，立即打开腹部，剥离腹部肿瘤组织，放入少许磷酸盐缓冲液，将肿瘤组织用手术剪剪至浆糊状，再用200目尼龙筛过滤。然后将滤液用缓冲液PBS冲洗3次，冲完后用600r/min的转速离心2min，除去大的细胞碎片。每根试管中加入70%乙醇1mL，用于固定细胞，然后放置于低温冰箱-20℃冻存，24h后溶解，离心去除乙醇，再用缓冲液PBS冲洗2次。加入混合溶液1mL（含0.1%柠檬酸三钠、0.3%TritonX-100、RNA酶、0.002%、0.01%PI，用0.9%氯化钠溶液配制），10min后用200目尼龙筛过滤，取滤液上机检测细胞周期[5-7]。

1.5统计学处理

统计学处理采用Stata7.0统计软件进行分析 各组资料以x±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组的抑瘤率和胸腺指数比较

实验结果表示，与模型对照组比较，复方金蟾胶囊各组小鼠平均肿瘤组织的重量均有明显降低，其中，大剂量组与其他两组比较，对HepA肝癌腹水瘤有更显著的抑制作用（P<0.01），胸腺指数也显著增高（P<0.01），并随着剂量的递增，抑瘤作用逐渐增强，显示出有较好的量-效关系。见表1。

2.2血清TNF-α浓度的测定

与模型对照组之间比较，3个药物治疗组的血清TNF-α浓度均明显降低（P<0.05）；而各治疗组之间互相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表2。

2.3金蟾胶囊对瘤细胞分裂各期的影响

复方金蟾胶囊各剂量组均能提高肿瘤细胞G0～G1期比例，减小S期比例，进而促进瘤细胞凋亡，其作用强度的变化呈剂量依赖性。金蟾胶囊各组对肿瘤细胞G2～M期的影响不大。结果见表3。

3讨论

复方金蟾胶囊是由蟾皮、东北虎骨草、藏雪莲、蝎子等珍贵中药精致提炼而成。为验证其临床抗癌效果，本研究通过复制移植HepA肝癌腹水瘤小鼠的建立模型，进行抗肿瘤实验研究。结果表明，复方金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤生长具有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性，其可能在诱导细胞分化、促进细胞凋亡、抑制血管生成、改变肿瘤细胞相关基因的表达等方面发挥抗肿瘤的作用。

血清中的TNF-α能严重破坏细胞因子间正向的协调作用，使细胞因子网络功能紊乱，造成血管渗漏、脂肪降解等病理损伤。而在实体瘤小鼠体内的TNF-α会异常升高[8-12]。本实验结果表明：金蟾胶囊能显著降低HepA肝癌腹水瘤小鼠TNF-α浓度，增加小鼠胸腺重量及胸腺指数，对于TNF-α水平异常升高的HepA肝癌腹水瘤小鼠起到明显的抑制作用，并控制在一个低水平状态，说明其是通过提高机体免疫作用来发挥其抗肿瘤疗效的。

实验中应用流式细胞仪检测各组小鼠HepA肝癌腹水瘤的细胞周期各时相分布，发现在复方金蟾胶囊的药物作用下的小鼠肝癌H22细胞细胞周期时相发生变化，使细胞增殖周期受阻，诱导肿瘤细胞发生凋亡；其S期细胞百分比明显减少，差异极显著；表明复方金蟾胶囊能明显阻滞肝癌H22细胞由G1期进入S期，使其停滞于G1/G0期，从而减少细胞在该期DNA的复制和合成，进而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

总之，金蟾胶囊抗肿瘤作用确切，可以进一步研究开发利用。

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（收稿日期：2012-09-13 本文编辑：陈 俊）