微波对老化甜菜种子萌发和早期碳氮代谢的影响

吴旭红，段政羽

（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006）

微波对老化甜菜种子萌发和早期碳氮代谢的影响

吴旭红，段政羽

（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006）

采用2450MHz频率，以不同时间和功率的微波对老化甜菜种子进行预处理，比较了不同处理剂量对其种子萌发及早期碳、氮代谢的影响。结果表明，微波能不同程度地影响老化甜菜种子的发芽状况及早期代谢中的物质转化，其影响强度因微波处理时间不同而异，呈现出明显的剂量效应和微波调控植物代谢的双重作用。低剂量（90W、20s）处理对芽长、芽活力指数、蛋白水解酶活力及游离氨基酸总量起促进作用（P＜0.05）；中等剂量（270W、10s）处理，种子发芽率、芽长、芽活力指数、可溶糖、可溶蛋白含量及淀粉酶活性在处理与对照之间及各处理之间差异显著（P＜0.01）；高功率（450W）则随微波辐射时间的延长，种子活力及萌芽内物质转化能力均呈下降趋势。说明适宜剂量的微波辐射，提高了老化甜菜种子的生理生化代谢机能。综合评价270W 10s不仅加速了原有储存物质的水解，而且促进早期的合成代谢，为形态建成奠定了基础，为促进老化种子萌发和早期发育的最佳处理。

老化甜菜种子；微波；氨基酸总量；酶活性；可溶性糖；可溶性蛋白

甜菜作为我国北方工业制糖的重要原料,其产量和含糖率的高低与品种种性和种子质量密切相关。由于甜菜起源于欧洲西部和南部沿海,在长期的驯化过程中形成了喜温凉的生物学特性。在我国主要分布在北纬40°以北的地区。在内蒙古、黑龙江、新疆及甘肃、宁夏等部分主产区具有明显的早春气温偏低并易发生倒春寒的气候特点,对甜菜的早期发育尤其是老化甜菜种子的萌发造成抑制,成为幼苗早发和全苗、壮苗的限制因素。

种子预处理是提高种子活力的有效途径。包括物理方法：如水分、温度及化学方法如水杨酸、氯化胆碱等。近年来,常作为信息传递而用于雷达和通讯技术中的“超高频电磁波”—微波,其生物效应日益显现。郝曜山、杨利艳采用2450MHz频率,以不同功率和时间组合的微波对小麦种子进行预处理,比较了不同处理对小麦种子萌发及幼苗生长的影响,得到了适宜功率不仅对种子萌发起促进作用（—短期效应）,而且还对幼苗生长、生化代谢和生物量的积累产生影响（—长期效应）的结论[1]；申志英等利用微波辐射对几种药用植物种子的萌发状况进行了研究,发现适量微波辐射不仅能不同程度解除种子休眠状态、提高芽率,且能缩短发芽天数,增加芽的生长速度[2]；陈怡平等对微波处理菘蓝种子的子叶发育与生物光子辐射的相关性研究表明,低剂量微波辐射促进了种子生理生化代谢机能,提高了种子的萌发率[3]；相关的研究在水稻、大豆等种子萌发的影响上也已见报道[4-5],但对甜菜种子萌发的生物学效应却未见相关研究。本文以不同微波功率和辐射时间为交互因子,研究其对老化甜菜种子早期代谢的影响,探索提高高纬地区直播甜菜老化种子活力、促进早期发育的可行性途径。

1 材料与方法

1.1材料

甜菜（Beta vulgaris L.）品种为德国KWS9419,为2007年由齐齐哈尔市种子经销处提供,常温下储于实验室内自然老化的种子。微波源为日本松下NN-K597WS型微波炉,功率为80～900W,频率为2450MHz。

1.2方法

1.2.1 微波处理取籽粒饱满大小一致的甜菜种子,先用70%的酒精消毒1min,再用5%的次氯酸钙溶液浸泡2h后,用无菌水冲洗干净,在常温下再用ddH2O浸泡10h。滤去水分将种子表面自然晾干后,将供试种子分成12组,每组50粒,分别进行90W、270W、450W,5s、10s、15s、20s辐射处理,以不做辐射为对照,每个处理设3个重复。

1.2.2 种子萌发实验及生理指标的测定种子萌发采用砂床发芽法。将处理过的甜菜种子播于细砂经清水浸泡1h,高温灭菌（130℃,3h）定量称重的培养皿中（50粒/皿）（D=12cm）,等量补充1/8 Hongland营养液至细砂湿润,置于人工气候培养箱中（25℃/20℃±1℃,光照10h、黑暗14h循环）发芽。每隔2d以1/8 Hongland营养液补充失水,每天记载发芽粒数,以5d累计发芽粒数为发芽势,以10d累计发芽粒数为发芽率。每24h进行记录,对萌发期的形态指标进行统计分析[6-7]。按张志良（1990）的方法测定蛋白质含量,可溶性糖的测定采用蒽酮比色法[8]。参照郭勇（1996）的方法测定氨基酸总量[9]。蛋白水解酶活性测定参见参考文献［10］。以上测定均采用3次重复,取平均值。

2 实验结果

2.1微波处理对老化甜菜种子活力的影响

由表1可见,90～270W范围内,10s、15s及90W的20s微波处理对发芽率的提高均有较大的刺激作用。经t检验比较后表明,90W各处理之间差异不显著（P＜0.05）,但15～20s处理分别比对照高24.0%、22.5%,均达到差异显著水平；270W10s、15s辐射发芽率分别是对照的1.31倍和1.60倍,处理之间及处理与对照之间达差异极显著水平（P＜0.01）；450W 5s处理比对照高42.6%（P＜0.01）,此后随着处理时间的延长,发芽率呈明显下降的趋势,15s、20s处理分别比5s降低了45.49%、56.80%,仅为对照的77.74%、61.61%,但10s处理仍比对照高11.7%,已呈现出不同剂量的微波处理刺激和抑制种子萌发的双面效应。

表1 微波处理对老化甜菜种子活力的影响

90W 20s与270W 10s、15s处理显著促进了甜菜下胚轴的伸长。与对照比较,分别是对照的1.57倍、1.64倍、1.95倍。450W处理除20s芽长低于对照外,其余各处理均高于对照,但处理与对照之间及各处理间差异不显著（P＜0.01）。

除270W 20s和450W 15s、20s外,各处理均使老化甜菜种子发芽指数有所提高。90W处理5s发芽指数与对照持平,10s、15s两处理间无差异（P＜0.01）,但与对照之间差异显著（P＜0.05）,20s处理发芽指数比对照高39.84%,已为对照的1.40倍。270W处理发芽指数的峰值出现在10s,此后迅速下降,20s处理仅为对照的87.76%。450W处理5s发芽指数是对照的1.25倍,10s与对照持平,15～20s发芽指数急剧下降,20s处理发芽指数仅为对照的64.84%。

发芽指数和活力指数是衡量种子发芽和整齐度的重要指标。90～270W范围内,5～15s处理随处理时间的延长和功率的加大活力指数加大,峰值出现在270W 10s和90W 20s。450W处理5～10s仍比对照高16.48%和8.05%,15～20s处理发芽指数降至对照以下。

从形态指标的分析表明,微波对老化甜菜种子发芽率、芽长、发芽指数及芽活力指数均有很大影响。适宜微波功率和处理时间组合的微波剂量能刺激萌发过程,加速种子内的物质转化,使萌发速度加快,时间缩短。但随处理剂量加大,各形态指标又呈下降趋势。

2.2微波处理对老化甜菜种子萌发期淀粉酶活性和可溶性糖含量的影响

图1 微波处理对老化甜菜种子萌芽可溶糖含量及淀粉酶活性的影响

如图1（a）所示,老化甜菜种子经90W微波处理后,其萌芽中各处理间可溶糖含量无明显变化,即处理间差异不显著（P＜0.05）,但与对照比较均加大,5s和20s分别比对照增加了29.45%、39.73%（P＜0.01）；270W处理5～10s可溶糖随处理时间的延长而增高,15s时仍维持较高水平,但已呈下降趋势,20s时可溶糖含量已降至270W10s的68.0%。10s、15s处理与其他处理之间达到差异显著水平（P＜0.05）,各处理与对照之间均达到差异极显著水平（P＜0.01）；450W的各处理随辐射时间的延长,可溶糖呈下降趋势。5s处理可溶糖是对照的1.95倍,10s仍比对照高34.93%,但15～20s已降至对照的95.2%、87.67%。5～10s范围内90～270W各辐射处理都促进了老化甜菜种子萌发阶段可溶糖的转化生成,15～20s处理可溶糖已降至对照以下,呈现出较强的抑制作用。说明在安全剂量范围内,微波处理可迅速激活体内碳素代谢相关酶活性,加速了储存多糖的水解转化。但微波剂量效应超过甜菜种子耐受时,由于热效应的累积,可能导致体内酶活力的降低,使甜菜种子早期糖代谢受阻。同时也表明微波处理具有明显的安全边际效应。

不同剂量的微波预处理对萌芽中淀粉酶活性有很大影响,见图1（b）。90W处理老化种子内淀粉酶活力随处理时间的延长而增加,15s和20s时分别比对照增加了22.26%、32.88%；270W处理淀粉酶活性呈先升后降的趋势,峰值出现在处理时间为10s,酶活力已达对照的1.85倍,此后下降,20s时酶活力仍为对照的105.23%,但比10s处理降低了43.07%。该剂量在处理之间及处理与对照之间均达到差异显著水平（P＜0.01）；450W处理随辐射时间延长淀粉酶活性逐渐下降,但5～10s处理酶活仍显著高于对照（P＜0.05）,15s时酶活出现骤降,20s时酶活力仅为对照的64.92%。

淀粉酶和可溶糖变化趋势表明,适宜强度的微波处理,增强了老化甜菜种子萌发期碳素代谢过程重要的酶活性,促进了物质转化,为早期发育中器官建成奠定了物质基础。

2.3微波处理对甜菜萌芽蛋白水解酶活性、可溶性蛋白及氨基酸总量的影响

蛋白水解酶活性在90W时随辐射时间的延长增加,5～10s酶活增幅缓慢（见图2）,10s处理仅比对照提高了14.71%,15s处理酶活力急剧增强,20s处理出现酶活力峰值,已达对照的2.41倍；270W处理5～15s范围内,蛋白水解酶活力随处理时间延长大幅上升,到达15s时,升幅减小,而此时酶活比对照增加了108.82%,20s处理有所下降,但仍然是对照的1.74倍。无论是处理之间还是处理与对照之间均达到差异显著水平（P＜0.01）；450W各处理随辐射时间增长酶活呈明显的下降趋势,且在15～20s时急剧降低,仅为对照的102.94%、76.47%。相同处理时间比较,5s内酶活呈现随功率加大而增加的趋势,450W处理的酶活为对照的2.03倍,分别比270W、90W处理提高了50.0%、122.58%；10～15s处理酶活都呈现随功率加大先升后降,且共同点为270W较90W比升幅都超过了24.56%,不同点为10s处理450W降幅较小16.18%,而15s处理酶活则骤降50.70%,微波处理的负效应已显现和加强,20s预处理酶活力随功率增加大幅度下降（450W仅为90W的31.71%）也进一步印证了微波生物效应的双重性。

图3（a）显示,经微波辐射后各处理的氨基酸总量均高于对照。其中90W 20s、270W 5s处理分别比相同时间的其他处理提高了40.43%、131.10%、97.95%、36.22%,是对照的2.47、2.85倍。90W各处理10s氨基酸总量略有下降,整体趋势呈现随处理时间增长氨基酸总量持续增高,20s时达到峰值（处理内）,5～15s处理间差异不显著（P＜0.05）,但各处理与对照之间差异显著（P＜0.01）。270W处理继峰值出现后,10～15s处理氨基酸总量水平稳定,20s处理明显下降。450W处理达10s时,氨基酸总量急剧下降,20s处理已降至5s的51.10%,但各处理仍高于对照。说明随着蛋白水解酶活性的增强,甜菜萌芽中游离氨基酸库容在加大。

图2 微波处理老化甜菜种子萌芽蛋白质水解酶的活性

图3 微波处理对老化甜菜种子萌芽氨基酸总量及蛋白质含量的影响

在辐射剂量组合中,相同处理时间不同处理功率比较,可溶性蛋白含量都表现出先升后降趋势。相同处理功率不同处理时间条件下,除5s处理外,其他供试样品均表现为随处理时间的延长可溶性蛋白含量呈下降的态势。除270W 10s和450W 5s比对照高12.82%、6.41%外,各处理的可溶性蛋白含量均低于对照,90W、450W 15s处理可溶性蛋白含量仅为对照的69.23%、56.41%,90W、270W 5s比对照降低了16.67%、11.54%。可溶性蛋白含量的变化表明,随着甜菜种子萌发,尤其是处理剂量的加大,可溶性蛋白含量与氨基酸总量的变化之间呈一定的负相关性。可能原因为,在适宜强度微波刺激下,加速了种子的早期代谢,使蛋白水解酶活性增强,加速了种子内储存蛋白的降解,因而使溶解状态的氨基酸含量大幅升高（90W 20s、270W 5s）。90W、450W处理蛋白水解酶活力最大值与氨基酸总量峰值叠加,而270W处理则分别出现在15s和5s。

随着蛋白水解酶活性的增强,90W10～20s可溶性蛋白含量逐渐减少,且各处理都低于对照,两者之间呈现负相关；而270W处理,可溶性蛋白含量比蛋白水解酶活性峰值提前（分别出现在10s、15s）；450W蛋白水解酶活性和可溶性蛋白含量两者之间并未呈现同步效应。

3 结论与讨论

甜菜种子的自然老化是一个非常复杂的过程,不仅包含众多的酶促生化过程,同时由于其长期储存在含水量低的环境中,非酶促的美拉德反应在种子衰老过程中发挥着更加重要的作用。美拉德反应是还原糖与游离氨基酸的α-氨基或蛋白质N-端氨基形成Shiff碱,进而糖酰类中间物进一步反应生成更复杂糖基化大分子聚合物的过程[11]。衰老的种子萌发期胚轴中美拉德产物增加,而美拉德产物的增加又与糖分的水解和可溶性蛋白合成能力的下降及过度消耗密切相关,从而导致可溶性糖、可溶性蛋白含量下降。

微波是频率为300MHz～300kMHz的电磁波,具有强穿透性、非电离性,可以深入到被辐射物质内部。当量子能量适中时,与被辐射物质相互作用,只改变其内部物质运动状态,并不破坏分子结构和维系该结构的作用力。本实验中,3种功率4个时间组合的微波剂量,其中低剂量90W对发芽率无影响,但20s处理时间时,显著提高了芽长和芽活力指数及蛋白水解酶活力；中等强度270W处理10s,对发芽指数和芽活力指数的促进作用大于对发芽率和芽长的影响,对淀粉酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高最为显著。15s时对发芽率、芽长、活力指数及蛋白水解酶活性都达到了极显著的促进作用。高剂量450W处理5s蛋白水解酶活力和可溶性蛋白含量变化显示,可能提前启动了氮代谢,不仅使储存蛋白的转化加强,同时也提高了蛋白质的早期合成能力。以上结果显示,微波对老化甜菜种子萌发的影响存在明显的剂量效应。这种低能电磁辐射剂量偏低,未能达到改变种子内部物质运动状态从而激发其活力的作用；适宜强度的辐射处理,引发了种子内部强烈的生物响应,使种子内器官分化和发育的物质转化和生化代谢加速；而高剂量处理则作为逆境,可能使膜脂过氧化作用加剧,电解质渗漏加强,从而使萌发期的物质代谢紊乱。也有可能在高功率下随辐射时间的延长,使分子内震荡加剧,破坏了维系生物大分子高级结构的次级键,使分子结构破坏,抑制了种子萌发。

在设定处理组合内,270W微波处理10～15s提高了淀粉酶活力及可溶性糖、蛋白质含量和氨基酸总量,很可能是微波热效应刺激诱导机体产生了热激响应（heatshock response,HSR）,导致转录调节因子激活了热激基因的表达。同时由于微波预处理增强了蛋白水解酶的活性,提高了氨基酸总量,提前启动了萌发的代谢过程,促进了组织器官分化,促进了苗期的发育进程。

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Effects of Microwave Pretreatment on Germination of Aging Beet Seed and Carbon and Nitrogen Metabolism in Early Stage Seedlings

WU Xu-hong,DUAN Zheng-yu

(Life Sciences&Farming and Forestry College,Qiqihaer University,Qiqihaer,Heilongjiang 161006,China)

In present study,seeds of aging beet were exposed to microwave irradiation(240 MHz frequency)in different time length and power.Seed germination and early stage carbon and nitrogen metabolism parameters were recorded and compared for seeds treated with different doses.The results showed that microwave pretreatment affected aging beet seeds germination and resources conversion in early stage metabolism to various degrees according to different time length of microwave radiation.Dual functions of dosage effect and regulation and control of plant metabolism by microwave have been revealed.Seedling length,vigor index,proteolytic enzyme activity and total free amino acid increased under low dosage treatment(90 W,20 s)(P＜0.05);Rate of seed germination,Seedling length,vigor index,soluble sugar,soluble protein concentration and activity of amylase showed significant difference not only between treatment and control,but also between each treatment (P＜0.01)under moderate doses(270 W,10 s);Pretreatment with 450W power decreased both seed vigor and resources conversion capabilities following the extension of microwave radiation time.The results demonstrated that physiological and biochemical metabolism of aging beet seed have been improved after treatment with appropriate dose of microwave radiation.Pretreatment dose of 270 W 10s not only accelerated the hydrolysis of the reservoir matter,but also promoted early synthetic metabolism,laid the foundation for the morphogenesis,and therefore is the besttreatmentto promote aging seed germination and early seedling development.

aging beet seed；microwave；amino acid content；enzyme activity；soluble sugar；soluble protein

S566.301

：A

1007-2624（2013）02-0017-04

2012-12-13

吴旭红（1962-）,女,黑龙江省齐齐哈尔市人,齐齐哈尔大学生命科学与农林学院教授。