延胡索总生物碱的提取纯化实验研究

侯晓琳 石 光 王新闻 尚 坤

（长春中医药大学，长春130117）

延胡索总生物碱的提取纯化实验研究

侯晓琳 石 光 王新闻 尚 坤*

（长春中医药大学，长春130117）

目的确定延胡索总生物碱的最佳提取及纯化工艺。方法 以延胡索乙素为总生物碱的考察指标，以正交试验优选延胡索总生物碱的最佳提取方法，考察树脂纯化延胡索总生物碱提取液的工艺条件。结果 延胡索总生物碱的最佳提取工艺为6倍量80%的乙醇提取3次，每次1.5小时。树脂纯化的最佳工艺为D-101大孔树脂，去离子水洗脱杂质，洗脱体积为7BV，95%的乙醇洗脱总生物碱，洗脱体积为7BV。结论 采用此种提取纯化方法，可以较好地提取纯化延胡索中总生物碱。

延胡索；提取；纯化

本品为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，具有活血，行气，止痛的作用，用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛等症。延胡索主要成分为总生物碱，主要为叔胺、季胺类生物碱，历代本草均有记载有活血散瘀、理气止痛的功效。现代科学实验表明延胡索具有镇痛、抗溃疡、抑制胃酸分泌、解痉及增加冠脉血流量，抗心律失常，抗菌等药理作用。在对中药延胡索的研究中发现，延胡索的主要成分中延胡索乙素，延胡索丑素二者的止痛和镇静作用较强，其中以延胡索乙素镇痛作用最强，对持续性、慢性钝痛有极佳镇痛效果。

1 材料与方法

1.1材料紫外分光光度计（仪器型号：TU-1810PC，序号05-1810-01-0034），十万分之一电子天平，真空干燥箱，恒温水浴锅。

树脂购自吉林省金泰化玻有限公司，延胡索乙素对照品（由中国药品生物制品检定所提供，批号：0726-200208，供含量测定用），醋延胡索（批号：12072779，河北康派中药材有限公司），经长春中医药大学姜大成教授鉴定为罂粟科延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的醋制品，无水乙醇，去离子水，所用试剂均为分析纯。

1.2延胡索总生物碱提取工艺结果

1.2.1延胡索总生物碱含量测定

1.2.1.1对照品溶液制备精密称取延胡索乙素对照品3.69mg用无水乙醇定容至50ml量瓶中，即得每1ml含延胡索乙素0.0738mg的对照品溶液。

1.2.1.2显色方法及检测波长的确定精密称取干膏1g加无水乙醇70～100ml容量瓶中，超声处理20分钟后，定容，过滤，弃去初滤液取续滤液0.5ml用无水乙醇定容至50ml容量瓶中，以无水乙醇溶液作为空白溶液，在紫外分光光度计进行全波长扫描，在282nm处有最大吸收峰，故选择检测波长为282nm。并在282nm处测量样品的吸光度值。

1.2.1.3标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液3、4、5、6、7、8mL，置于10ml容量瓶中，在282nm波长处测定吸光度，以对照品溶液的体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.01451X-0.11462，r=0.9995，表明对照品浓度在22.14～59.04ug／ml与吸光度之间呈良好的线性关系。

1.2延胡索提取工艺的优选延胡索具有镇痛止痛的功效，其主要药效物质为生物碱类，生物碱类成分易溶于乙醇中。所以首先对乙醇的浓度做单因素考察。以60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇为提取溶剂，进行平行试验，以延胡索乙素为对照品，在紫外分光光度计下测得吸光度值为0.600、0.570、0.644，其对应的总生物碱的含量分别为246.25mg／g、235.9mg／g、261.4mg／g。所以选择80%的乙醇作为正交试验的提取溶剂。对影响乙醇回流提取的主要影响因素：煎煮时间、提取次数、提取溶剂按四因素三水平表L9（34）进行正交试验，各因素水平见表1，按正交试验表安排试验，并对延胡索总生物碱的含量进行方差分析，结果见表2。

表1 正交试验因素水平

按照L9（34）正交表进行试验，试验方法如下：

取延胡索饮片150g，共9份，按正交表设计进行试验，具体试验安排如下：

1号样品：加乙醇量4倍，煎煮1次，煎煮1小时。

2号样品：加乙醇量6倍，煎煮2次，煎煮1小时。

3号样品：加乙醇量8倍，煎煮3次，煎煮1小时。

4号样品：加乙醇量6倍，煎煮1次，煎煮1.5小时。

5号样品：加乙醇量8倍，煎煮2次，煎煮1.5小时。

6号样品：加乙醇量4倍，煎煮3次，煎煮1.5小时。

7号样品：加乙醇量8倍，煎煮1次，煎煮2小时。

8号样品：加乙醇量4倍，煎煮2次，煎煮2小时。

9号样品：加乙醇量6倍，煎煮3次，煎煮2小时。

综合评分：以延胡索乙素的含量作为考察指标。

2 结果

见表2、表3。

表2 正交试验［L9（34）］及结果分析

表3 方差分析结果表

2.1提取工艺的验证性试验由于确定的最佳提取方案，在正交设计表中未出现，故进行验证性试验。取延胡索饮片150g，共3份，按确定的最佳提取工艺进行提取，水浴浓缩，80℃减压干燥，考察总生物碱的含量。结果见表4。

表4 验证性试验结果

2.2延胡索总生物碱纯化材料选择研究结果该工艺需要使延胡索总生物碱的含量达到50%以上才能保证中药新药口服制剂对有效部位含量的要求（大于50%）。而验证试验得到的总生物碱的含量为39.90%，故选择大孔树脂对其进行纯化。

2.2.1树脂型号的筛选将延胡索提取液平均分成2份，分别加入2种型号的大孔树脂（D-101，AB-8，X-5），依次用去离子水和95%的乙醇进行洗脱，计算延胡索总生物碱的提取率（解析后所得的总生物碱量与上柱前提取液中总生物碱量的比值），结果见表5。

表5 树脂型号筛查（%）

2.2.2杂质洗脱剂的选择取2根相同型号的玻璃层析柱，分别以10%乙醇溶液和去离子水进行洗脱，每1BV接收1份，紫外检测总生物碱的含量，同时观察洗脱液的颜色，确定洗脱液的用量。结果见表6。

2.2.3总生物碱洗脱剂种类与用量的筛选取三根相同型号的玻璃层析柱，分别以50%乙醇、80%乙醇和95%乙醇洗脱吸附在层析柱上的延胡索总生物碱，每1BV接收1份，紫外检测总生物碱的含量，以洗脱液中总生物碱含量为指标，确定洗脱剂及用量。结果见表7。

表6 杂质洗脱剂的选择（n，%）

表7 总生物碱洗脱剂的选择

上述实验结果表明：洗脱7个体积柱时，95%乙醇总生物碱含量已经很低，50%和80%乙醇仍含有一定量总生物碱，考虑到成本，确定总生物碱洗脱剂为95%乙醇，洗脱7个体积柱。

3 讨论

方差分析显示，煎煮次数对试验结果具有极显著性影响，各因素对试验结果影响的重要性依次为B＞A＞C，即煎煮次数B是主要影响因素，加醇量A是次要影响因素，而煎煮时间C对试验结果影响极小。

直观分析结果显示，各因素的最佳水平依次为：A因素的第2水平，B因素的第3水平，C因素的第2水平，即A2B3C2；考虑生产实际中，确定A2B3C2为最佳提取方案。

验证性试验结果表明，三批样品的总生物碱含量的RSD为1.09%，重现性良好，含量指标略高于正交设计的水平，故确定A2B3C2为最佳提取工艺。

由试验结果可知，D-101大孔树脂分离纯化延胡索总生物碱提取率较高，故确定选用D-101型大孔树脂。

前面实验表明，10%乙醇溶液洗脱杂质时，总生物碱损失较多，而去离子水能较好的保留总生物碱不被洗脱下来，所以选择去离子水为杂质洗脱剂。通过观察去离子水洗脱到6个柱体积后，洗脱液颜色已经很浅，水溶性杂质基本上已经洗掉，确定杂质洗脱剂用量为6个柱体积。

本试验针对延胡索总生物碱纯化工艺进行研究，得到D-101树脂适合延胡索总生物碱纯化，去离子水洗脱杂质效果理想，洗脱体积为6个柱体积，采用95%乙醇洗脱总生物碱，洗脱体积为7个柱体积。按以上方法做3组平行试验得到总生物碱的平均含量为58.72%，符合总生物碱含量要求。

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.12.101

1672-2779（2013）-12-0154-02

��吴义红

2013-05-16）

*通讯作者