用荟萃分析法评估酵母培养物对奶牛生产性能的影响

■ Gerald D.Poppy等 钟懿华(译)

（美国达农威公司，美国依阿华州锡达拉匹兹 52404）

近年来“荟萃分析（meta-analysis）”已成为总结科学研究数据的一项普及的统计工具。相较于单一的科学实验，荟萃分析能以统计方法同时分析由许多科学实验总结而成的庞大文献数据库。在过去，分析与总结庞大文献数据库相当耗费时间，且有时几乎是不可能完成的工作，因此导致研究人员得出“需要进行更多的实验研究”这样无效率的建议。现今，研究人员能以荟萃分析这个统计工具来简化数据分析这项工作，并使其更有效率，最终能更精准地的总结出一个有意义的结论。要进行荟萃分析，首先研究人员必须收集所有相关的发表、与未发表文献，然后根据一套已清楚定义的统计方法与步骤，来检视所收集到文献数据的质量。针对符合质量要求的数据，对其严格地进行统计分析。相较于在狭隘、评论式的研究中，是由研究人员本身来对不同的实验给予其重要性排序，而荟萃分析则是以各个实验的样本数与方差来排序各个实验。如此，荟萃分析提供了一个透明、客观、且能重复验证的统计方法来分析文献数据。使用荟萃分析法分析文献数据的其它优点还包括：①验证实验组的无效结果是否为真，亦或是由于统计功效过低；②验证实验组的结果是否为其它外源性因素所影响；③验证文献中是否存在有发表偏见（例如样本数较小或是负面结果的实验被选择性不发表）。

美国专业动物科学家登录机构（ARPAS）与美国乳业协会（ADSA），在美国乳业协会2011年的年度研讨会里，共同举办了一个“了解荟萃分析”的专门座谈会。与会的专业研究人员认为，对“宣称”以荟萃分析法针对某一特定商业产品的功效进行评论的科学论文，该类论文须提供以下信息才能被认定为正确的荟萃分析论文（Lean等，2009）：①针对某一特定商业产品所进行的所有实验都必须被包括在荟萃分析里，而且：a.该荟萃分析须以正规且严格的统计方法[例如漏斗图（Fun⁃nel Plot）；Light等，1984]，检视其所使用的文献数据库里是否有发表偏见。b.除了提供漏斗图之外，该荟萃分析还必须提供森林图（Forest Plot），让读者能以视觉检视来自所有不同实验的结果趋势，以及每一个实验对该荟萃分析所造成的影响及95%的可信区间。根据作者所提供的森林图，读者能自行确认方差是否被正确地包含在数学模型计算里。②该荟萃分析的文献数据，须来自于同种动物。例如所有的实验应以奶牛为实验对象，不应包括奶羊或是水牛。③市面上的酵母培养物产品不止一个，但这些酵母培养物产品的组成成分各有不同。而荟萃分析中所采用的各种文献数据，必须要求来自同一产品。以本篇文章为例，所有的数据皆来自于针对同一酵母培养物（美国达农威酵母培养物）所做的实验，并不包括来自其它公司酵母培养物或是活酵母产品实验的数据。当然，其所取得的结果也不能够套用在其它的酵母培养物身上。

1 背景

在市面上有许多酵母相关产品在商业化牧场中被广泛地使用（北美市场使用率约为32%；Hutjens,2012）。至今已有许多实验试图探讨酵母产品对改善奶牛生产性能的影响，但这些科学论文的结果却不一致。造成酵母产品效果不一致的原因，可能是因为某些科学实验样本数过少，以致于无法达到能侦测出酵母产品效果的统计功效。而另一个更为重要的原因则是因为研究者将不同性质的酵母产品经常混为一谈，从而导致结果的不一致性。市售的酵母产品主要分为两大类：酵母培养物与活性干酵母（又称活酵母）。美国饲料管制协会（AAFCO,2011）对活性干酵母的定义为：每克产品需含有大于150亿个活酵母细胞；而其对酵母培养物的定义为：一种包含有酵母细胞及其赖以生长的培养基的产品（简单地讲，就是含有酵母发酵时产生的代谢产物、变形培养基和少量残余酵母的混合物）。由于含有大量的酵母细胞外代谢产物，酵母培养物的组成成分是最为复杂的，而且酵母培养物的功效与酵母细胞本身的活性并无直接的关系。其它酵母产品分类还包括：干燥酵母、辐照干酵母、啤酒干酵母、圆酵母、与酵母萃取物。虽然这些产品包括活性干酵母，在分类名称上均含有“酵母”这个名词，但它们无论是在组成成分上还是在功能作用方面与酵母培养物均是大相径庭的。2009年发表在美国乳业科学期刊上的一篇荟萃分析（Desnoyers等，2009），正是将不同性质产品混为一谈的一个范例，该荟萃分析的目的，在探讨活性干酵母对奶牛干物质采食量、瘤胃发酵与产奶量的影响，但是该荟萃分析所使用的文献数据中却包含了13篇探讨酵母培养物的实验。基于上述原因，原著作者针对某一酵母培养物（美国达农威酵母培养物）对改善奶牛产奶性能的功效，以正确的荟萃分析方法做了一个总结（Sanchez，2009），该荟萃分析的结果已于2012年发表于美国乳业科学期刊上（Poppy等，2012）。本文的目的旨在摘要介绍该荟萃分析研究实验所取得的重要结果，并为该荟萃分析中所探讨的酵母培养物对促进奶牛生产性能的作用机理做一个解释性的阐述。

2 荟萃分析

在Poppy等（2012）的荟萃分析中，首先其所探讨的酵母培养物制造商（美国达农威公司）提供该公司在2011年以前所有针对奶牛所进行的酵母培养物饲喂实验的文献与数据，其中包含已发表的与未发表的科学论文与技术报告，并从6个以英语为发表语言的搜索引擎来搜寻其它饲喂奶牛相同酵母培养物的相关科学文献。所使用的搜索引擎为：PubMed、Google Scholar、Agricola、ScienceDi⁃rect、Scirus与CAB。所使用的搜寻关键词为：酵母（yeast）、奶牛（cows）、与泌乳期（lactation）。

2.1 文献筛选标准

所有收集到的文献实验，都必须经过一套标准的程序来进行筛选。要能够被包含在荟萃分析里，该实验必须符合以下所有标准：①该实验必须评估至少一种由同一公司所生产销售的酵母培养物产品；②该实验必须包含阴性对照组，与使用随机实验组分配方法；③该实验必须使用泌乳奶牛（不能使用干奶牛,或是体外发酵实验）；④该实验必须使用平行对照组实验设计（例如包含至少一组对照组，与一组实验组），不能使用交叉实验设计；⑤该实验必须报告至少一种生产性能结果，再加上提供方差或是实验组与对照组结果显著不同的概率。生产性能结果包括：产奶量、能量校正乳、乳脂率、乳脂产量、乳蛋白率、乳蛋白产量、3.5%乳脂校正乳、或干物质采食量。方差包括标准错误或是标准偏差。

2.2 统计分析方法

荟萃分析根据Higgins等（2008）所提出的方法来进行。数据分析则是使用Comprehensive Me⁃ta-Analysis version 2.2.050（Biostat,Englewood,NJ,USA）软件针对萃取出的生产性能数据来进行分析。实验组效应的异质性或是不均一性则是以卡方检验与I2统计法（Higgins等，2003）。荟萃分析所使用的文献数据库里是否带有发表偏见则是以漏斗图来检视（Light等，1984）。漏斗图中不带偏见的实验效应大小的最佳估计数则是以Trimand-fill方法来估计（Duval等，2000）。详细统计方法请参阅原著（Poppy等,2012）。

3 结果与讨论

3.1 荟萃分析文献筛选

在Poppy等（2012）的荟萃分析中，该酵母培养物的制造商提供了总计61篇文献报告,其中包含已发表的且经同行评审的科学期刊论文、科学期刊摘要、报告、与技术报告。另外通过6个以英语为发表语言的科学论文搜索引擎，并没有搜寻到其它相关的文献报告。在这61篇文献中，总计有36个不同的实验通过筛选程序。实验未通过筛选程序的原因为：只有阳性对照组（实验数目=17）；使用交叉、拉丁方、或是析因实验设计（实验数目=6）；或是未报告实验组结果（实验数目=2）（详细文献列表与被淘汰文献列表，请参阅原著表1与其附件表S1；http://www.journalofdairyscience.org/）。

3.2 实验效应异质性的检视

检验实验效应的异质性或是不均一性是荟萃分析中相当重要的一环，因为异质性这个统计方法，可以比较与检视所有通过筛选的不同实验之间与个别实验本身在实验效应上的异质性程度。以个别实验来看，实验效应的异质性可解释成实验组本身所造成的影响（例如日粮里有酵母培养物与无酵母培养物的差异）。至于不同实验之间的实验效应异质性程度，主要来自于不同实验之间的差别，例如不同实验之间对实验设计与奶牛管理方式的不同。在Poppy等（2012）的荟萃分析里，是以卡方检验的概率与I2统计法来检视其文献数据里实验效应的异质性程度。卡方检验在于检视一个零假设：在所有不同的实验之间，实验组的影响程度都是一样的。如果卡方检验的概率P≤0.10，代表能接受该零假设的概率小于10%，即有超过90%的概率在所有不同的实验之间，实验组的影响程度是不同的。而I2统计法则是在比较不同实验间与个别实验间，实验效应异质性的程度。举例来说，如果I2值较高（I2＞35%），代表实验跟实验间的实验效应异质性程度超过预期，表示该荟萃分析的数据库可能测量超过一种结果（例如某一酵母培养物对促进奶牛生产性能的功效）,因此试图整合该数据库并从中推论出一个平均效应（例如该酵母培养物的功效）是不适当的。高I2值同时也可反映出该实验效应（例如该酵母培养物的功效）实际上可能被其它因素所影响着，例如：品种的差异、日粮配方的差异、日粮饲喂方式的差异、或是泌乳期的差异。高I2值也有可能是实验效应受实验设计的影响，例如：实验组是如何随机分配的，是否有盲组，是否有控制外源性混杂因素，实验单位是以个别奶牛还是以畜栏为单位。

从Poppy等（2012）的初步荟萃分析来看，不同实验间与个别实验间的实验效应呈现高度异质性（例如该酵母培养物对奶产量的影响：I2=40.46%，卡方检验Q值概率为P=0.003）。表示有除了实验效应本身（该酵母培养物）以外的因素（实验设计、奶牛管理方式）在影响着荟萃分析结果。通过分组分析（Poppy等，2012），相较于使用所有的文献数据，如果仅使用经同行评审的科学期刊，不同实验间与个别实验间的实验效应高度异质性则不复存在。举例来说，使用未经同行评审的科学期刊来进行荟萃分析，其I2=57.16%，与卡方检验Q值概率为P=0.001；但若仅使用经同行评审的科学期刊来进行荟萃分析，其I2=0.001%，与卡方检验Q值概率为P=0.904，表示仅使用经同行评审的科学期刊所进行的荟萃分析，其所导出的结果则是受该酵母培养物对其所产生的影响，并不受来自于其它外源性因素的影响（Poppy等，2012）。

3.3 该酵母培养物对奶牛生产性能的影响

在Poppy等（2012）的荟萃分析中，总结经同行评审的科学期刊结果显示（见表1），饲喂奶牛该酵母培养物每天能额外增加1.61 kg的3.5%乳脂校正乳产量[95%可信区间：0.92到2.29 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.906]与1.65 kg的能量校正乳产量[95%可信区间：0.97到2.34 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.795]。在乳脂肪与乳蛋白产量方面，饲喂奶牛该酵母培养物每天能额外增加0.06 kg的乳脂肪产量[95%可信区间：0.01到0.10 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.802]与0.03 kg的乳蛋白产量[95%可信区间：0.00到0.05 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.805]。

表1 该酵母培养物对泌乳牛产奶性能的影响①

以不同泌乳期来看（见表2），对泌乳初期奶牛（泌乳天数小于70 d），饲喂奶牛该酵母培养物每天能增加0.62 kg的干物质采食量[95%可信区间：0.21到1.02 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.766]与1.37 kg的产奶量；对泌乳中后期奶牛（泌乳天数大于70 d），饲喂奶牛该酵母培养物每天减少0.78 kg的干物质采食量[95%可信区间：-1.36到-0.21 kg；I2=0.001%与卡方检验Q值概率为P=0.530]，并同时每日增加0.98 kg的产奶量。以整个泌乳期来看，饲喂奶牛该酵母培养物平均每天能额外增加1.18 kg的乳产量（95%可信区间：0.55到1.81 kg）。

表2 不同泌乳期喂饲该酵母培养物对泌乳奶牛产奶量与干物质采食量的影响

3.4 荟萃分析的质量管理

在Poppy等（2012）的荟萃分析中，将该酵母培养物对产奶量与干物质采食量的影响趋势以森林图呈现出来。在Poppy等（2012）里，该酵母培养物对产奶量有增加的趋势。且该酵母培养物对不同泌乳期奶牛产生不同的影响：在泌乳前期，该酵母培养物有增加干物质采食量的趋势;但在非泌乳前期（例如泌乳中后期），该酵母培养物则有降低干物质采食量的趋势。

另一个评判荟萃分析质量的重要标准，在于检视其所使用的文献是否有发表偏见。虽然荟萃分析可以根据所有的文献数据以数学模式来总结出实验的效应，但若其所使用的文献数据里存在着偏见，例如被选择性发表的数据，那么其所总结出的实验效应也会被偏见所影响。发表偏见之所以存在，是因为某些科学期刊或是研究人员倾向不发表负面效果或是规模过小的实验，或是企业倾向发表有正面产品效应的实验。漏斗图可作为一种以视觉来检查发表偏见的方法，用其来检视是否有实验大小与实验效应程度的关系存在。在Poppy等（2012）的荟萃分析中检视了在所有的实验中，针对该酵母培养物对奶牛产奶量的影响，是否有发表偏见的存在。从结果可以看出该漏斗图并不对称（空心圆点的分布状态），表示可能有许多小规模的实验被选择性不发表。根据Trimand-fill方法来仿真被选择性忽略掉的小规模实验（实心圆点），如果小规模实验没有被忽略掉的话，实际的漏斗图看来就相对对称。另一个对不对称漏斗图的解释，可能是所含括的实验间其实验效应异质性过高所导致。如果仅检视经同行评审的期刊（Poppy等，2012），漏斗图看起来对称，且无实心圆点，代表该数据库里并不存在着发表偏见。

3.5 该酵母培养物对促进奶牛生产性能的作用机理

在Poppy等（2012）的荟萃分析中所探讨的市售酵母培养物是一种能够有效控制瘤胃发酵，帮助泌乳牛从日粮中萃取出更多可消化养分的天然饲料添加剂。该酵母培养物是一种复杂的发酵产物，其包含对动物有益的细胞外发酵代谢产物，包括抗氧化物、有机酸、小肽、核酸、植物甾醇,以及能够支持动物免疫与健康的酵母细胞壁，包括ß-葡聚糖与甘露聚糖。根据对该产品的深入研究，总结该酵母培养物对促进泌乳牛生产性能的作用机理包括：①滋养瘤胃细菌暨促进瘤胃微生物的代谢平衡、②优化瘤胃内的微生态环境、③改善瘤胃功能即其后续消化道的消化吸收效率、④与提高瘤胃内挥发性脂肪酸的產量与微生物蛋白的合成数量。

3.5.1 滋养瘤胃细菌暨促进瘤胃微生物的代谢平衡

实验证明该酵母培养物可以增加瘤胃功能性微生物的生长与活性。实验结果包括：①增加瘤胃细菌总数以及瘤胃纤维分解细菌族群数量（Wiedmeier等，1987；Harrison等，1988），可促进瘤胃内纤维的消化分解与通过速率。②增加瘤胃蛋白分解细菌的数量（Yoon等，1996），可促进瘤胃内氮的利用。③在体外发酵实验中增加乳酸利用细菌的数量（Callaway等，1997），可减少乳酸在瘤胃中的堆积。④增加瘤胃中嗜氧气原生虫并降低噬细菌原生虫族群的相对数量（Arakaki等，2000），可促进瘤胃中氧气的清除并减少瘤胃细菌被原生虫吞噬的机会（Ivan等，2000）。⑤以体外发酵槽培养中国常见的粗饲料，例如：稻米秸秆、玉米秸秆、玉米秸秆青贮、或是全株玉米青贮，可增加瘤胃真菌的族群数量（Mao等，2012），因此可促进瘤胃对纤维的消化。

3.5.2 优化瘤胃内的微生态环境

要维护瘤胃的健康与功能，必须确保瘤胃的酸碱值（pH）稳定在一个安全的范围之内，如此才能使瘤胃微生物对纤维的分解消化优化。一般而言，瘤胃发酵程度越高，其所产生的挥发性脂肪酸就越多，瘤胃的pH值也因此而降低。但当瘤胃的pH值降低到6以下时，瘤胃的纤维消化功能会受到影响。该酵母培养物的一个特殊的功效，就在于能促进瘤胃发酵与增加挥发性脂肪酸的生成，但同时不对瘤胃的pH值产生剧烈的影响。该酵母培养物对优化瘤胃环境的实验结果如下：①随着该酵母培养物在培养液中添加量的增加，体外瘤胃发酵槽中挥发性脂肪酸的产量也随之增加，但是培养液的pH值并没有随之降低，而是维持在一个较高或是与对照组相同的水平(Doto等，2011)。这个稳定培养液pH值的功效，是来自于该酵母培养物对乳酸利用菌的增生效果，乳酸利用菌能将乳酸转变为丙酸，因而减缓了pH值的下降（Callaway等，1997）。②增加一般采食量（＜26 kg干物质）奶牛的瘤胃淀粉消化率，但减缓高采食量（＞26 kg干物质）奶牛的瘤胃淀粉消化率（Allen，2012）。在以高淀粉支持高产奶量的饲喂状况下，该酵母培养物可以帮助稳定瘤胃环境。③增加瘤胃中嗜氧气原生虫族群的相对数量（Arakaki等，2000），因此加速瘤胃中氧气的清除，帮助瘤胃维持在一个低含氧的状态（＜1 μg/kg；Russell，2002），让厌氧菌得以存活并发挥功能。

3.5.3 改善瘤胃功能与后续消化道的消化吸收效率

该酵母培养物对优化瘤胃功能性微生物的功效可以反映在消化率上。例如：①在瘤胃尼龙袋实验中，增加了玉米青贮干物质与纤维的瘤胃降解率（Yoon等，1998）。②在体外发酵实验中，增加了百慕达干草与苜蓿干草的降解率（Sullivan等，1999）。③减少粪便中未消化完整玉米颗粒达14%，因此反应出该酵母培养物可增加全肠道对精料的消化率（Yoon等，1999）。

3.5.4 提高瘤胃内挥发性脂肪酸的产量与微生物蛋白的合成数量

瘤胃挥发性脂肪酸可为宿主奶牛提供高达80%的能量来源。而流入奶牛小肠的过瘤胃蛋白，其中约50%～90%为瘤胃微生物蛋白所提供。经实验证实，该酵母培养物可成为提升瘤胃挥发性脂肪酸与微生物蛋白合成的有效工具。①在一个体外连续发酵槽实验中，相较于对照组，该酵母培养物增加培养液中总挥发性脂肪酸与丙酸的产量（Miller-Webster等，2002）。②在瘘管牛实验中，该酵母培养物增加瘤胃微生物蛋白的合成以及流入小肠的微生物蛋白含量（Allen等，2012；Hristov等，2010）。该酵母培养物对瘤胃微生物蛋白的功效，是来自于其对瘤胃功能性微生物生长与活性的正面效果，以及其能降低噬细菌原生虫族群的数量，因此能减少瘤胃细菌被原生虫吞噬的机会，从而增加小肠中过瘤胃微生物蛋白的含量。

4 结论

Poppy等（2012）以荟萃分析总结36篇经同行评审的科学期刊，其结论数据显示，在商业化牧场的实际生产实践中，使用某一酵母培养物可以改善奶牛的生产性能。该酵母培养物能增加奶牛的产奶量，以及乳脂肪与乳蛋白产量，其结果为增加能量校正乳产量。在北美以乳脂肪与乳蛋白计价的市场中，使用该酵母培养物可让营养师与牧场经营者在设计奶牛日粮时有更多的选择。使用该酵母培养物可以增加泌乳初期（泌乳天数小于70 d）奶牛的干物质采食量（每日增加0.62 kg）[此功能性功效已获得美国食品药物管理局(FDA)认可]，这个优势可为关注泌乳初期奶牛健康的牧场经营者提供一个有效的提升食欲的工具。对于泌乳中、后期牛隻（泌乳天数大于70 d），使用该酵母培养物则可以减少奶牛的干物质采食量（每日减少0.78 kg），并维持甚至是提升奶产量，这个使用该酵母培养物的特殊优势，可以增加泌乳中、后期奶牛的饲料利用效率，在现今高饲料成本的挑战下，提升泌乳中后期奶牛的饲料利用效率能为牧场经营者带来更高的经济效益。此外，使用荟萃分析法为某一特定产品的功效进行评估，可为动物科学家提供一个检验产品实际应用效果的有效科学工具。使用荟萃分析评估产品功效的优点，不是使用样本数较少的小型实验，或是把不同性质产品混为一谈且不评估其所使用文献数据质量好坏的评论式研究所能够比拟的。实验效应异质性的评估，是荟萃分析中很重要的一个步骤，因为该步骤能让研究人员清楚地了解到，除了实验组本身的效应外，是否还有其它的外源性因素影响了荟萃分析的结果。

（参考文献25篇，刊略，需者可函索）