基因诊断技术的临床应用进展

高 媛，郑文岭，马文丽

(南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515)

基因诊断彻底打破了常规诊断方式，不再以疾病的表型为主要依据推测疾病的发生及机制，而是采用分子生物学和分子遗传学方法，直接检测被检者某一特定基因的结构或者功能是否异常，从而对相应的疾病进行诊断。相对于常规诊断，基因诊断更注重个体基因状态，不仅可以对患者所患疾病做出判断，也可以对表型正常但携带有某种特定疾病基因或者特定疾病的易感者做出预测［1-2］。随着分子生物学和分子遗传学的快速发展，更先进、更成熟的基因诊断技术不断涌现，本文将基因诊断中常用的分子生物学技术及其在临床中的应用做一综述。

1 分子杂交技术及相关技术

分子杂交技术包括Southern杂交、Northern杂交、Dot杂交和Western杂交。该技术主要有3个步骤:核酸的分离与纯化、探针的制备和分子杂交。Southern杂交、Northern杂交和Dot杂交也称核酸的分子杂交，用于检测特定的DNA、RNA，其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的温度和离子强度下，根据碱基互补配对原则退火时形成稳定的异源双链。以已知核酸片段作为探针并加以标记，杂交过程高度特异。Western杂交又称免疫学测定，用于检测特定的蛋白质，其基本原理是利用单克隆或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应检测蛋白质。目前，在分子杂交技术基础上形成多种新的技术，如荧光原位杂交(FISH)、多色荧光原位杂交(MFISH)、比较基因组杂交(CGH)等。临床中常用杂交技术诊断遗传病、癌症、感染性疾病等，比如镰刀型细胞贫血症、苯丙酮尿症(PKU)、β地中海贫血、结核分枝杆菌检测等。目前已有商业性核酸探针试剂盒用于临床鉴定一些重要的分枝杆菌。另外值得一提的是荧光原位杂交技术广泛用于检测染色体重组和标记染色体，检测多种基因疾病的染色体微缺失和非整倍体疾病的产前诊断，同时在血液学领域中荧光原位杂交技术也得到越来越广泛的应用，尤其是在白血病诊断、治疗、监测、预后评估和微小残留病检测等方面成为不可缺少的重要手段。

2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术及相关技术

PCR基本原理是双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在PCR基础上，已经发展了包括多重PCR、多重巢式PCR、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)、PCR直接分析法(DA)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、序列特异引物PCR(PCR-SSP)、PCR寡核苷酸探针杂交(PCR-SSO)和PCR产物直接测序分型(PCRSBT)等多种PCR衍生技术。RQ-PCR具有灵敏、特异、技术成熟和操作简便等优点，对于临床上明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择合适治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值［3］。除了作为艾滋病疗效观察的有效检测手段外，RQ-PCR技术常用于检测白血病融合基因，结果准确、稳定。此外，该技术在产前监测和产前基因诊断也具有重要意义，比如β地中海贫血症。目前对遗传性物质改变引起的疾病还无法进行根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴的出生。RQ-PCR可以对患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行特异、定量、准确的检测，有效地检出病婴。PCR直接分析法常用于α-地中海贫血症、Barts胎儿水肿综合征、肌营养不良症(DMD)等疾病的快速诊断。另外，在我国相当一部分单位，也有应用PCR-SSCP、PCR-DGGE和多重PCR技术对G-6-PD缺乏症、乙型肝炎病毒、β地中海贫血症、苯丙酮尿症(PKU)、杜氏肌营养不良症(DMD)进行临床病例的诊断［4］。

3 免疫组织化学技术和免疫细胞化学技术

免疫组织化学和免疫细胞化学技术都是利用抗原与抗体的特异性结合反应来鉴定组织或细胞中特定化学物质的化学方法，具有较高的敏感性和特异性。免疫组织化学技术可在组织切片、细胞涂片上进行蛋白质或多肽类物质的定位、定性和定量，是研究和观察细胞中某些结构或分子物质及组织细胞间成分的主要手段，已成为病理学科中不可缺少的技术支持。免疫细胞化学在鉴定上皮性、间叶性或淋巴性肿瘤方面以及淋巴瘤亚型分类中发挥着重要作用。临床中常采用这种技术进行穿刺、破碎或微量标本的确诊、转移性肿瘤的原发病灶的确定、恶性淋巴瘤的诊断和分类、确定肿瘤的分化程度、肿瘤细胞增生程度的评价以及雌孕激素受体的检测等等。该技术不仅提高病理诊断的准确性，对肿瘤和其他疾病的治疗也具有十分积极的意义。比如D2-40是一种与生殖细胞肿瘤和胎儿睾丸精原细胞相关的唾液酸糖蛋白，常用来标记淋巴管的内皮细胞，因间皮细胞表达D2-40，故可采用免疫化学对恶性间皮瘤与癌进行鉴别。Campos等［5］采用该技术发现，神经生长因子受体(TrkA)在卵巢癌中的表达高于正常卵巢，推测TrkA和神经生长因子(NGF)可以作为卵巢癌靶向治疗的靶点。

4 基因芯片技术

基因芯片是通过微量点样技术等方法，把大量基因的cDNA作为探针固定于支持物即载体玻片上(通常支持物上的一个点代表一种分子探针)，提取待测组织的mRNA，通过反转录获得其cDNA，经荧光标记，与载体玻片上探针进行杂交，杂交信号通过基因芯片扫描仪收集，由特定的分析软件进行分析，从而对基因序列及其功能进行大规模高通量的研究。基因芯片诊断技术具备快速、高效、敏感、平行化和自动化等特点，能快速、准确地从分子水平诊断疾病。基因芯片的出现，使得高通量集成化的分析成为可能。应用基因芯片在临床医学中进行研究目前已经取得初步进展。比如:1)疾病临床早期诊断和批量筛选。将疾病的特异性基因片段或致病病原体的基因片段固定于芯片上，可制成疾病诊断芯片。提取患者样本中的核酸进行标记作为探针，利用探针与芯片杂交，扫描杂交结果，可分析得到该例患者是否患有此类疾病，这就是临床检验芯片原理。目前，肝炎的诊断、地中海贫血病的筛选、性病的批量检测等等，都有相应的基因芯片的开发和应用。2)确定疾病亚型和选择最佳治疗方案。在芯片上固定同一种疾病不同类型的特征性基因，我们可以得到某种疾病的分型基因芯片。由于同种疾病的各个亚型在临床表现上非常相似，仅依靠临床症状往往难以区分，正确地分析亚型对于疾病的治疗以及预后情况分析具有十分重要的指导作用［6］。3)耐药基因的筛选以及新药的研发。如果长时间使用同一种药物，病原体会对该药物产生耐受性，进而影响疗效。因此，我们需要在鉴定分离耐药基因的同时开发新的有效药物。利用基因芯片技术，我们不仅可以找出疾病特异性相关的致病基因，并且可以通过研究相应的抑制药物，观察细胞或者机体用药之后的反应，从而为新药的研发开辟一条新的路径。乙型肝炎病毒耐药芯片是目前较为成熟的临床检验芯片。已有的研究表明，通过耐药芯片的实时监测，检测患者血液中的病毒突变情况，在耐药性即将产生时，改变治疗策略，可以得到很好的治疗效果。因此基因芯片可以有效地辅助临床治疗方法。

5 新一代基因测序技术

新一代基因测序技术提供了一种和基因芯片技术互为补充的新的高通量工具，通常新一代基因测序技术指的是一个技术群，不同的新一代基因测序技术，在原理上存在较大的差别。目前，已经市场化或者接近市场化的基因测序技术主要有3种，分别是Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。这3种测序技术虽然不同于传统的基因测序技术，但是他们都有一个共同之处:均使用反应信号的实时阅读，在测序反应进行的同时收集反应信号，因此测序成本可以大幅度消减。新一代测序技术除了在科研领域(比如通过检测人类基因组上基因拷贝数变异、基因缺失研究人类基因的多态性等)应用广泛外，在临床医学也有着广阔的应用前景。比如:1)遗传病的诊断。White等［7］建立了针对 Angelman综合征和 Prader-Willi综合征SRNPN基因甲基化检测平台，诊断率达到100%。2)传染性疾病的快速诊断。采用该技术可以有效地预防在国内曾经爆发的甲型H1N1流感和SARS等传染疾病，避免疾病的大规模爆发流行，也为较短时间内制定疫情防控策略提供科学依据和坚实保障。3)个体化医疗。新一代基因测序技术的出现急速降低了基因测序的成本。将来类似人类基因组规模的测序，预计仅1 000美元就可以完成。目前，临床医学已进入从群体治疗向个体化医疗转变时期，越来越多的疾病根据个体的遗传学信息制定针对性的预防疾病措施和治疗方案，譬如肿瘤的靶向治疗。

6 基因诊断的前景与挑战

随着科研人员对疾病发生发展的分子生物学机制的深入研究，以及“人类基因组计划”的顺利实施，人们越来越清晰地认识到基因与疾病的关系。目前，科研人员更多地关注如何发展和利用基因检测技术找寻致病基因、解码个体基因、评估患病风险，进而对个体进行基因诊断与治疗;因此，基因检测、诊断技术迅速崛起，逐渐改变现有的医疗模式［8］。在基因诊断逐渐兴盛的同时，由于不能准确地评估患病风险，以及对一些可以检测的致病基因所引发的疾病没有有效的预防和治疗措施，基因检测结果反而成为思想负担。尽管基因诊断技术存在以上缺陷，但这些问题都无法抹杀该项技术对人类健康所做的贡献。相信随着医学技术的不断发展，凭借人体基因密码预测相关疾病的风险性，做到早检测、早预防、早治疗，基因诊断技术在临床的应用会有一个更加广阔的前景。

［1］Zechi-Ceide RM，Jesus-Oliveira NA，Guion-Almeida ML，et al.Clinical evaluation and COL2A1 gene analysis in 21 Brazilian families with Stickler syndrome:identification of novel mutations，further genotype/phenotype correlation，and its implications for the diagnosis［J］.Eur J Med Genet，2008，51:183-196.

［2］府伟灵.基因诊断治疗与预测医学［J］.第三军医大学学报，2009，31:24-25.

［3］Mikael KA，Jose MA，Martin B，et al.The real-time polymerase chain reaction［J］.Mol Aspects Med，2006，27:95-125

［4］朱平.利用PCR衍生技术检测血液系统疾病［J］.中华检验医学杂志，2009，32:6-9.

［5］Campos X，Muñoz Y，Selman A，et al.Nerve growth factor and its high-affinity receptor trkA participate in the control of vascular endothelial growth factor expression in epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2007，104:168-175.

［6］任莉莉，李富荣，戴勇.基因芯片技术在临床医学研究中的应用［J］.现代诊断与治疗，2002，13:159-160.

［7］White HE，Durston VJ，Harvey JF，et al.Quantitative analysis of SNRPN(correction of SRNPN)gene methylation by pyrosequencing as a diagnostic test for Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome［J］.Clin Chem，2006，52:1005-1013.

［8］Silver JN，Flotte TR.Towards a rAAV2 based gene therapy for ADA2 SCID:from ADA deficiency to current and future treatment strategies［J］.Pharmacogenomics，2008，9:947-968.