DNA主动去甲基化相关通路的研究进展

金巧智 综述，蔡志毅 审校

(1.温州医学院第一临床医学院，浙江 温州 325000;2.台州市立医院耳鼻咽喉-头颈外科，浙江 台州 318000)

对于DNA去甲基化的研究以往都是以DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)为靶向分子，通过抑制DNMT来恢复抑癌基因的功能，从而达到治疗肿瘤的目的。去甲基化药物就是通过抑制DNMT的活性使复制后的DNA不能再次甲基化，从而导致所有等位基因表现为去甲基化，使抑癌基因得以恢复表达，抑制肿瘤的生长。虽然去甲基化药物的出现将肿瘤的治疗带到了一个新的高度，但是仍有很多问题亟待解决，比如DNA去甲基化的确切机制及其靶向特异性。目前研究发现DNA去甲基化主要有两种方式:一种是在原生殖细胞和早期胚胎中都可以发生的主动DNA去甲基化[1]，这一过程不依赖于DNA复制，受酶的催化，使5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)转化为未甲基化的胞嘧啶;另一种是通过与复制相关的过程发生的被动DNA去甲基化[2]，即在DNA复制时，DNA甲基化模式的维持受到干扰，没有保留原有甲基化模式，随着复制的进行，甲基化的CpG岛被“稀释”，导致DNA去甲基化。

尽管在很多细胞进程中都存在DNA主动去甲基化，但是关于主动去甲基化的潜在机制仍存在很多争论[3]。目前研究发现DNA主动去甲基化可能涉及到的通路有6个，即5mC脱氨基化与BER偶联通路、碱基切除修复(base excision repair，BER)通路、5mC甲基团脱氢通路、核苷切除修复(nucleoside resection repair，NER)通路、水解反应直接去除甲基团、5mC氧化去甲基化[3-5]。与这些通路相关的酶和因子有:胞嘧啶脱氨酶:AID，APOBEC1[6-7];TET 蛋白:TET1，TET2 等[8-9];延伸复合物蛋白:ELP1，ELP2等[10];碱基切除修复蛋白:RNF4，TDG 等[11-13];核苷酸切除酶:GADD45a，GADD45b[14-15];DNA甲基转移酶:DNMT3a，DNMT3b;DNA 糖基化酶:EME，DML2 等[16-17]。但其中哪个或哪些具有真正的DNA去甲基化活性尚待验证。本文综述最新文献资料，介绍其中主要通路及其相关的酶和因子。

一、5mC脱氨基偶联BER通路与AID蛋白

AID(activation induced deaminase)蛋白在 B淋巴细胞免疫球蛋白基因的种类转变重组(species change restructuring，CSR)和体细胞超突变(somatic mutations，SHM)中发挥重要作用[18]，能使5mC脱氨基变为T，造成T/G错配，在卵母细胞、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、胚胎生殖细胞和原生殖细胞(primordial germ cells，PGC)的DNA去甲基化中也起重要作用，AID的缺失会阻遏DNA去甲基化。利用重亚硫酸盐新一代测序技术绘制的13.5日龄PGC的全基因组甲基化图谱，证明活化诱导AID的缺失会影响PGC 全基因组甲基化消除[6]。Popp 等[6]研究还发现，AID完成对5mC的脱氨基修饰后，留下的T/G错配可激活DNA修复通路，其中倍受关注的是AID与BER偶联的DNA去甲基化通路。Hajkova等[13]也发现PGC全基因组去甲基化过程可激活DNA修复通路，他们在小鼠PGC中发现，XRCC-1和 PARP-1与染色质结合的同时，DNA甲基化水平降低，表明正在发生去甲基化的PGC中有BER通路参与。BER通路中发挥部分作用的DNA糖苷酶可以逆转AID的脱氨基作用导致T/G错配。在斑马鱼中AID和甲基化CpG结合蛋白家族成员中的MBD4一起，促进DNA去甲基化[12]。据报道，Aid-/-小鼠PGC基因组甲基化水平高于野生型，Aid基因缺失主要影响内含子、转座子以及部分外显子的去甲基化，而启动子甲基化水平与野生型相当。但是Aid-/-的PGC中仍发生一定程度的去甲基化[19]，暗示AID对整个基因组的去甲基化作用是有限的。或者说其促进去甲基化作用可能存在序列特异性。最近的研究报道，AID缺失会干扰总DNA的去甲基化，在ES+体细胞聚合物中，AID参与像 OCT4或NANOG这些多潜能细胞的去甲基化[7]。利用RNA干扰技术阻断人类成纤维细胞和小鼠ESC中的AID后，两者融合形成的异核体中多能性相关基因Oct4和Nanog的启动子处于甲基化状态，使Oct4和Nanog基因表达受到限制[20]，表明AID可能在体细胞DNA甲基化再编程及其多能性诱导过程中起重要作用。

二、BER 通路与 TET、Apobec 1、TDG蛋白

TET(ten eleven translocation)蛋白被认为是一种候选DNA去甲基化酶，Tahiliani等[8]用JBP(base J binding protein，存在于锥体虫属中，可对胸腺嘧啶进行羟基化修饰)家族蛋白的酶活结构域进行了反复的序列比对，找到了TET1、TET2和TET3。TET1是一种Fe2+依赖性的5mC加氧酶，并预测人类TET1蛋白具有5mC羟基化酶活性，能促使DNA上的5mC转变为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)。他们通过薄层色谱法(TLC)、质谱分析法(MC)等一系列生化实验以及过表达，RNAi等细胞学实验证实了其预测。同期发表的另一篇文章[21]在机体内也发现了5hmC的存在，从侧面也印证了这一研究。在小鼠上做的进一步研究已经证实3种TET家族成员能够使5mC转变为5hmC，通过对敲除TET1的小鼠的研究证实，这种蛋白在早期胚胎发育过程中，对于保持胚胎干细胞的多能性具有潜在的作用[9]。在体外培养的小鼠 ESC中发现，TET1通过将5mC转化为5hmC调节DNA甲基化水平，使Nanog基因保持激活状态，从而维持ESC的多能性[15]。同样，在人胚肾细胞HEK293细胞系和小鼠ESC中也发现TET1的5mC修饰作用，并且发现敲除TET1能导致5hmC水平下降[14]。在胚胎干细胞中，TET使5mC转变为5hmC的生物学过程首先发生在主动转录基因，Tet1蛋白不仅能调控富含CpG启动子区的DNA甲基化水平，而且能促进干细胞中与多能性相关的因子的转录，以及参与多梳靶向(具有靶向作用的大分子复合物)的发育调控因子的抑制，而且与基因的转录增加有关[22-23]。在最新的研究中，宋洪军等[24]将小鼠分为电休克治疗(electric shock therapy，ECT)样电刺激处理组及对照组，然后利用遗传工具结合聚合酶链反应(PCR)技术对来自这些小鼠大脑组织细胞中的基因组微小区域进行了扩增，随后对这些DNA片段上胞嘧啶状态进行了比较分析。利用先进的基因测序技术，研究人员分析了2组小鼠脑细胞中DNA特殊区域的胞嘧啶甲基化状态(包括普通胞嘧啶、甲基化胞嘧啶、羟甲基化胞嘧啶)。研究结果表明ECT确实诱导了去甲基化，而TET1是这一过程的关键性作用因子，同时提到了另一种脱氨酶Apobec1(apolipoprotein B RNA-editing catalytic component-1)，TET1 使5mC转变为5hmC，而Apobec1则进一步促使羟基化胞嘧啶转变为胞嘧啶，同时发现5hmC的去甲基化需要BER通路的参与。而徐国良等[25]研究发现，无论是体外的细胞还是培养的细胞，DNA第5种碱基5mC、第6种碱基5hmC可以进一步形成第7种碱基 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。这种新的修饰碱基会被自动识别出来，并依靠胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase，TDG)从基因组中切除，再通过DNA的剪切修复，替换为没有修饰成分的胞嘧啶。为了弄清5hmC的去甲基化机制，Wossidlo等[26]将小鼠合子中的父源基因组DNA主动去甲基化现象与DNA修复机制联系到了一起，通过观察合子内甲基化水平的动态变化以及DNA复制、DNA断裂、DNA修复发生的精确时间，发现DNA链断裂标记(γH2A.X)、BER通路标记(PARP-1)和DNA甲基化水平的降低都在合子雄性原核形成的第三个阶段(PN3期)开始出现，暗示合子中的DNA主动去甲基化与BER通路存在联系。在PN3期雄性原核中能检测到XRCC-1(BER通路核心组件)和PARP-1信号，但几乎检测不到ERCC1(NER通路核心组件)和XPA(NER通路组件之一)信号[13]，进一步说明合子中DNA主动去甲基化的DNA修复可能通过BER通路。

三、5mC中的甲基脱氢通路与ELP3蛋白

ELP(elongator complex protein)蛋白是1999年Otero等[27]在研究酵母RNA聚合酶Ⅱ(RNA PⅡ)复合物各成分的性质时，从酵母染色质的RNA PⅡ/DNA/RNA三元复合物中分离得到的，它与转录延伸过程中磷酸化的RNA PⅡ结合。ELP由6个亚基组成的2个亚单位构成，Elp1/2/3构成较大的亚单位，Elp4/5/6构成较小的亚单位。Elp3亚基是中心亚基，起着将其他亚基组装成整体的作用[28]。Elp亚基中有一个铁硫簇的结构域，能够结合S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine，SAM)，这在去甲基化反应中发挥关键作用。ELP3蛋白在合子DNA主动去甲基化过程中起重要作用[3，10]，被敲除后阻碍合子中父源DNA的去甲基化[10]。在受精前向MⅡ期卵母细胞内注射编码ELP3结构域突变体mRNA，发现ELP3中含有铁硫簇的S-腺苷甲硫氨酸残基结构域突变可阻止父源DNA的去甲基化[10]。生物信息学证据表明，SAM残基超家族蛋白催化包括DNA甲基化在内的许多反应[29]。ELP3的 SAM残基结构域可利用SAM产生5'-脱氧腺苷残基，使5mC甲基团脱氢，进而发生一系列生化反应而生成5hmC并最终转化为未甲基化胞嘧啶[3]。然而，由ELP3介导的去甲基化尚缺乏直接证据，它所催化的去甲基化具体生化反应也有待进一步验证。

四、NER通路与Gadd45a蛋白

Gadd45(Growth arrest DNA-damage-inducible protein 45)蛋白家族包括 Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g，它们的序列高度保守并且是细胞应激反应的关键因子[30]。其中，Gadd45a在细胞增殖、DNA修复、细胞周期和细胞凋亡中发挥重要作用[31-32]。Barreto等[33]研究发现 Gadd45a 在非洲爪蟾蜍卵母细胞的主动去甲基化进程中发挥着重要作用，Rai等[12]在对斑马鱼受精卵的研究中也发现Gadd45a能促进DNA的主动去甲基化。最新的一项研究揭示了成骨干细胞终端分化中存在DNA主动去甲基化调控方式，而且Gadd45a在该过程中发挥了关键作用[34]。该研究以成骨分化间充质干细胞为实验模型，研究发现，Gadd45a介导的成骨基因去甲基化调控主要发生于启动子的中等密度区，而非通常认为的具有较高密度的CpG岛[35-36]，而且Gadd45a介导的主动去甲基化主要发生在若干特定的CpG位点上，如Dlx5的-913和-800、Runx2的-820和-808、BGP的-1003以及Osterix的 -727和-632 CpG位点，提出在DNA主动去甲基化过程中可能存在一种位点特异性去甲基化机制。研究还发现，Gadd45a通过与启动子直接结合而发挥作用，它对成骨基因的主动去甲基化调控可能是通过NER途径实现的。

五、展望

以TET家族为代表的5mC羟化酶的发现，使TET在DNA去甲基化的过程中发挥的作用受到越来越多的关注。已经知道TET1催化5mC羟基化是DNA主动去甲基化的关键一步，去甲基化是由5mC的修饰开始，而不是直接的移除其甲基团。虽然很多的研究表明在动植物中广泛的存在DNA主动去甲基化，但其潜在的分子机制还有待继续深入研究。

在研究DNA去甲基化机制的同时，DNA主动去甲基化的靶向作用机制也开始受到了关注[1]。有研究结果显示，DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)在治疗肿瘤的同时也增加了肿瘤浸润、转移的危险性[37]。在乳腺癌细胞系MCF-7和2R-75-1中加入5-aza-CdR后，肿瘤细胞增殖减低、抑癌基因RSSSF1A表达恢复、细胞周期改变、裸鼠体内肿瘤生长速度减慢。但同时也诱导了6种原浸润、原转移基因，使它们的启动子发生去甲基化，产生基因不稳定性。因此，再深入研究DNA去甲基化机制的同时，如何使去甲基化更具特异性和靶向性，尽可能降低对其他方面的负面影响也将成为今后去甲基化研究的目标。

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