胎球蛋白A在骨矿化早期的抑制作用

吕厚辰 综述 唐佩福 审校

解放军总医院 骨科，北京 100853

生物矿化是矿物质在生物体内特定部位选择性沉积的过程，它严格受生物体内激素、细胞因子等生物信号分子的调控[1]。生物矿化中最常见的无机质是磷酸钙类，其代表为羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2][2]。生理状态下的矿化主要发生在骨骼和牙齿中，并以骨基质的矿化为主。骨基质矿化指以I型胶原为支架，羟基磷灰石结晶在各种胶原蛋白及相关酶类、脂类协同作用下发生沉积现象[3]。这一过程可以简单的概括为：机体将无机离子运输到具备一定超分子结构的有机组装框架处，以此框架为模版，矿物质规律沉积。与体外矿物沉积、析出不同，生物体内的矿化是具有选择性的，即在某些需要矿化的部位如骨、牙齿，机体是促进矿物沉积的； 而在其他部位如血液、肌肉等不出现矿物沉积。显然有一种抑制矿化的机制发挥了作用，这种抑制机制应该与矿化促进机制同等重要[4]。本文就胎球蛋白A在上述矿化过程中发挥的调节作用进行综述。

1 胎球蛋白A抑制矿化的作用

人胎球蛋白A(Fetuin-A)，亦称AHSG(2-Heremans Schmid glycoprotein)，于1944年由Pederson发现，是一种59kU的糖蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员[5]。胎球蛋白A主要在肝脏合成，在血液中浓度很高，成年哺乳动物中达0.5-1.5mg/ml。其D1结构域中的β折叠样结构与钙有很强的亲和性[6]，在血液循环中形成可溶性的钙-胎球蛋白颗粒，维持矿物离子的稳定，防止其聚积，是体内最强大的抑制矿化的蛋白质[7]。

Jahnen-Dechent等[8]利用培养的敲除胎球蛋白基因的小鼠进行实验，证明矿物在体内聚集沉积是一个自发出现的现象，不需要机体主动参与，但为了保证合理有序的沉积，机体须主动抑制这一趋势，在合适的部位取消这种抑制作用。Jahnen-Dechent等[6]发现：胎球蛋白A以可溶的胶体样纳米颗粒来维持过饱和矿物溶液中离子的稳定，通过D1区β折叠结构中的天冬氨酸和谷氨酸残基与钙结合，使矿物质以另一种形式溶于体液中，从而抑制矿物质的沉积。

通过序列结构对比发现：胎球蛋白A的D1结构域中存在一个EF手型结构(该结构由29个氨基酸组成的钙结合基序，含E、F两段螺旋，并形成螺旋-环-螺旋结构)的钙结合基序：92EGDCDFQLLK101，编号92-101氨基酸序列能发挥结合钙的作用[9]。在与矿物质结合的过程中，D1结构域中结合的钙不是以钙离子形式存在，而是以矿化离子聚集后形成矿化前体，即Posner矿物聚集簇的形式存在[10]。但这种前体结构及组成尚未明确，可能为无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate，ACP)、二水磷酸氢钙(dicalcium phosphate dihydrate，DCPD)、磷酸八钙(octacalcium phosphste，OCP)等[11]。胎球蛋白A与钙、磷等矿物质前体结合形成复合体[12]，即钙-胎球蛋白颗粒。最初形成的颗粒是可溶性的球状胶体物质，直径约30~150 nm，随着矿化的发展，颗粒内部的矿物质逐渐成熟，体积增大，由非晶体转变为晶体结构，并不可溶[13]。胎球蛋白A在这一过程中，能够维持矿物质的稳定，将逐渐成熟且不可溶的矿物质从细胞外液中转移到目的矿化位点，使矿化的反应链继续发展。

2 钙-蛋白颗粒的形成是一个多步骤过程

相关学者对胎球蛋白A的矿化抑制机制进行了系列研究，发现钙-蛋白颗粒的形成是一个多步骤过程[11]。即从钙-胎球蛋白单体逐渐发展到初级钙-胎球蛋白颗粒，最后转变为次级钙-胎球蛋白颗粒。每个阶段内胎球蛋白A均可以发挥抑制矿化的作用。

2.1 钙-胎球蛋白单体 矿物离子在亚稳定溶液中能够自发形成矿化前体，胎球蛋白A通过D1区β折叠结构与矿物质进行螯合，形成含有矿物质负载的胎球蛋白单体。钙-胎球蛋白单体最初是通过小角度中子散射技术观察到的[10]，在含有钙负载的胎球蛋白单体中，钙是以Ca9(PO4)6的形式与胎球蛋白A单体紧密连接在一起。溶液中的矿物离子无需任何有机物质参与自发地形成小的聚集物，即Posner矿物聚集簇，这是一种体积较小的矿物质-胎球蛋白颗粒，能作为一个整体与胎球蛋白A分子1∶1的结合在一起。Heiss等[10]发现：当溶液中离子浓度接近饱和极限时，仅有一半的离子和5%的胎球蛋白A处于钙-胎球蛋白颗粒内，剩余的离子及95%的胎球蛋白A则以含有钙负载的胎球蛋白A单体的形式存在。胎球蛋白A能够与自发聚集形成的Posner矿物聚集簇结合，抑制Posner矿物聚集簇进一步聚集，进而阻止矿物沉积出现。说明约95%胎球蛋白A单体在抑制矿物沉积上发挥积极的作用。

2.2 初级钙-胎球蛋白颗粒 当含有矿物负载的胎球蛋白A单体形成后，随着时间的发展，胎球蛋白A单体能够相互聚集形成一个体积较大的球形颗粒，胎球蛋白A位于球的表面，与胎球蛋白A单体结合的Posner矿物聚集簇则被包绕其中，这种临时稳定的钙-胎球蛋白A颗粒，同样能够抑制矿化的进一步发展。此时形成的复合体颗粒称为初级钙-胎球蛋白颗粒。Rochette等[14]人通过小角度的X线技术发现： 初级钙-胎球蛋白颗粒的直径＜100 nm，内部的矿物质为非晶态的矿化前体，是由早期与胎球蛋白A单体结合的Posner矿物聚集簇发展而来。Wu等[15]发现胎球蛋白A本身对矿化本身无直接抑制作用，它抑制矿化的作用机理是抑制成核后矿化前体的聚集和长大，进而避免出现了大的矿物质团块，最终间接地阻止了矿物质沉积。

2.3 次级钙-胎球蛋白颗粒 初级钙蛋白颗粒是一个不稳定的过渡结构，经过一段时间的延迟，其内部的非晶态矿物质逐渐转变为晶态矿物质，体积增大为原来的2倍，颗粒形态也从球形被逐渐拉长，包绕在颗粒周围的胎球蛋白A聚集的更加紧密，逐渐过渡到一个稳定阶段，此时该颗粒称为次级钙-胎球蛋白颗粒，或者成熟的钙-胎球蛋白颗粒[16]。转变为次级钙-胎球蛋白颗粒后，颗粒不会继续增大，在生物体温下维持稳定30 h[17]，这为生理性矿化时矿化位置、矿化时机、以及多余矿化颗粒的清除提供了充足的时间。Wald等[17]通过电镜观察发现，形成的次级钙-胎球蛋白颗粒中，除含有大量胎球蛋白A之外，还含有很多血浆白蛋白和其他酸性蛋白，说明存在一些功能类似矿化抑制蛋白的共同作用，保证矿化的有序进行； 除胎球蛋白A外，其他抑制性蛋白均为辅助性蛋白。很多学者研究次级钙-胎球蛋白颗粒形成和转变的条件，发现多种因素如： 胎球蛋白A的浓度、矿物离子的浓度、温度等都能对这一过程产生影响。Jahnen-Dechent等[18]发现提高胎球蛋白A的浓度，则会形成小的钙蛋白颗粒，同时颗粒稳定的时间延长，矿化被抑制的更明显； 提高温度、矿物离子浓度，降低胎球蛋白的浓度，可以加速钙蛋白颗粒的形成和转变过程，颗粒稳定的时间则缩短。

3 钙-胎球蛋白颗粒的清除

Herrmann等[19]最近发现钙-胎球蛋白A颗粒是由巨噬细胞系统清除的，在小鼠肝脏和脾脏边缘位置的Kupffer细胞能吞噬钙-胎球蛋白A颗粒，而且清道夫受体SR-AI/II缺陷的小鼠对钙-蛋白颗粒的清除能力比野生型小鼠的清除能力要弱50%； 他们认为SR-AI/II受体可以介导巨噬细胞清除钙-胎球蛋白颗粒，通过激活网状内皮系统可以加快这些颗粒的吸收，进而可以减少异位矿化或病理钙化的可能。Nagayam等[20]也发现了巨噬细胞类似的作用。目前已经证实，胎球蛋白A可以认为是一种血浆调理素蛋白，能够影响树突状细胞的吞噬作用，影响巨噬细胞的病理性凋亡，调理膦脂颗粒的活性。实验培养的人血管平滑肌细胞可以清除胎球蛋白A[21]，而且在次级钙-胎球蛋白A颗粒中，由于颗粒表面胎球蛋白A大量聚集，能够使清道夫细胞与胎球蛋白A间的连接更为集中和紧密，因而实验中发现颗粒状的钙-胎球蛋白A颗粒较单体清除快。

4 展望

认识矿化早期体内存在的抑制机制，能够进一步加深我们对生物矿化的认识，同时也为探索体内矿物过度沉积、骨质增生、移位骨化等疾病和骨替代材料在体内生物学改变提供新的思路[22-23]，通过加强胎球蛋白A这一类抑制性蛋白的活性或者适度激活内皮网状系统的活性，或许能够在一定程度上抑制或减缓疾病的进程，但这仍有待进一步的研究。

1 Fang PA， Conway JF， Margolis HC， et al. Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108（34）： 14097-14102.

2 Glimcher MJ. The nature of the mineral component of bone and the mechanism of calcification［J］. Instr Course Lect， 1987， 36 ：49-69.

3 Gorski JP. Biomineralization of bone： a fresh view of the roles of noncollagenous proteins［J］. Front Biosci， 2011， 16 ：2598-2621.

4 Schinke T， McKee MD， Karsenty G. Extracellular matrix calcification： where is the action?［J］. Nat Genet， 1999， 21（2）：150-151.

5 Pedersen KO. Fetuin， a New Globulin Isolated from Serum［J］.Nature，1944，154：575.

6 Jahnen-Dechent W， Trindl A， Godovac-Zimmermann J， et al.Posttranslational processing of human alpha 2-HS glycoprotein（human fetuin）. Evidence for the production of a phosphorylated single-chain form by hepatoma cells［J］. Eur J Biochem， 1994，226（1）：59-69.

7 Price PA， Caputo JM， Williamson MK. Bone origin of the serum complex of calcium， phosphate， fetuin， and matrix Gla protein ：biochemical evidence for the cancellous bone-remodeling compartment［J］. J Bone Miner Res， 2002， 17（7）：1171-1179.

8 Jahnen-Dechent W， Schinke T， Trindl A， et al. Cloning and targeted deletion of the mouse fetuin gene［J］. J Biol Chem， 1997， 272（50）：31496-31503.

9 Brown WM， Dziegielewska KM， Saunders NR， et al. The nucleotide and deduced amino acid structures of sheep and pig fetuin. Common structural features of the mammalian fetuin family［J］. Eur J Biochem， 1992， 205（1）：321-331.

10 Heiss A， Pipich V， Jahnen-Dechent W， et al. Fetuin-A is a mineral carrier protein： small angle neutron scattering provides new insight on Fetuin-A controlled calcification inhibition［J］. Biophys J，2010， 99（12）： 3986-3995.

11 Heiss A， DuChesne A， Denecke B， et al. Structural basis of calcification inhibition by alpha 2-HS glycoprotein/fetuin-A.Formation of colloidal calciprotein particles［J］. J Biol Chem，2003， 278（15）：13333-13341.

12 Price PA， Lim JE. The inhibition of Calcium phosphate precipitation by fetuin is accompanied by the formation of a fetuin-mineral complex［J］. J Biol Chem， 2003， 278（24）： 22144-22152.

13 Toroian D， Price PA. The essential role of fetuin in the seruminduced calcification of collagen［J］. Calcif Tissue Int， 2008， 82（2）：116-126.

14 Rochette CN， Rosenfeldt S， Heiss A， et al. A shielding topology stabilizes the early stage protein-mineral complexes of fetuin-A and Calcium phosphate： a time-resolved small-angle X-ray study［J］.Chembiochem， 2009， 10（4）： 735-740.

15 Wu CY， Martel J， Young D， et al. Fetuin-A/albumin-mineral complexes resembling serum calcium granules and putative nanobacteria： demonstration of a dual inhibition-seeding concept［J］.PLoS One， 2009， 4（11）：e8058.

16 Heiss A， Eckert T， Aretz A， et al. Hierarchical role of fetuin-A and acidic serum proteins in the formation and stabilization of Calcium phosphate particles［J］. J Biol Chem， 2008， 283（21）： 14815-14825.

17 Wald J， Wiese S， Eckert T et al. Structure and stability of calcium phosphate- fetuin-A colloids probed by time-resolved dynamic light scattering［J］. Soft Matter，2011，7 ： 2869-2874.

18 Jahnen-Dechent W， Heiss A， Schäfer C， et al. Fetuin-A regulation of calcified matrix metabolism［J］. Circ Res， 2011， 108（12）：1494-1509.

19 Herrmann M， Schäfer C， Heiss A， et al. Clearance of fetuin-acontaining calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-a［J］. Circ Res， 2012， 111（5）： 575-584.

20 Nagayama S， Ogawara K， Minato K， et al. Fetuin mediates hepatic uptake of negatively charged nanoparticles via scavenger receptor［J］.Int J Pharm， 2007， 329（1-2）： 192-198.

21 Reynolds JL， Joannides AJ， Skepper JN， et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular Calcium and phosphate concentrations： a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD［J］. J Am Soc Nephrol， 2004， 15（11）：2857-2867.

22 王宇玫，王士雯，佟欣，等．胰岛素样生长因子-1对血管异位钙化作用的研究［J］.军医进修学院学报，2002（1）：14-17．

23 陈华，田学忠，张伯勋，等．硫酸钙植入兔股骨髁包容性骨缺损骨密度分析［J］.军医进修学院学报，2009，30（5）：695-697．